电化学miRNA生物传感器:纳米技术的好处

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1 德黑兰大学新科学与​​技术学院生命科学工程系,伊朗德黑兰

2 伊朗亚兹德伊斯兰阿萨德大学亚兹德分校纺织与聚合物工程系

3 沙希德·贝希什蒂医科大学医学先进技术学院医学生物技术系,伊朗德黑兰

4 Tarbiat Modares大学生物科学学院纳米生物技术/生物物理系,伊朗德黑兰

抽象

纳米技术在医疗技术尤其是生物医学诊断中的重要性是不可否认的。通过利用纳米材料的优势,迄今为止已经开发了许多医学诊断方法,包括电化学纳米生物传感器。它们已用于量化不同的临床生物标记物,以检测,筛选或跟踪疾病。 microRNA(miRNA)是用于各种疾病(包括不同癌症类型)的生物医学诊断的最新,最可靠的生物标记之一。另外,在出版物,专利和/或商业设备中已经解释了许多电化学纳米生物传感器,其已经被制造用于检测或定量有价值的miRNA。本文的目的是回顾医学诊断,生物传感器,电化学生物传感器的概念,并强调纳米技术在纳米生物传感器的开发和性能中的作用,并将其应用于生物医学诊断中的microRNA检测。我们还总结了用于miRNA检测的电化学纳米生物传感器领域中的最新想法和进展,并解释了重要的突破。

图形概要

电化学miRNA生物传感器:纳米技术的好处

关键词


介绍

纳米技术凭借其不同的优势和应用,彻底改变了我们的生活[1]。与金不同的纳米材料[23]迄今已用于生物医学应用,例如诊断[4, 5]。纳米生物传感器一词是纳米技术在生物传感器中的应用,已在各种科学论文和专利中用于医学应用,特别是电化学纳米生物传感器[6, 7]。电化学纳米生物传感器汇集了电化学方法,纳米技术和生物分子选择性的优势[8, 9]。因此,它们是当今医学诊断最重要的方法之一[10, 11 ]。

随着人类对各种疾病的发生,传播和传播机制的了解的增加,为预防,诊断和治疗提供了新的策略。尽管近年来由于科学技术的进步,这些过程得到了更快,更高效的升级,但是,诸如癌症等致死性疾病病例的增加表明,开发能够提供快速,精确的早期检测系统的重要性和紧急性。 ,以及低价的诊断结果[12, 13 ]。

在疾病的生物医学检测中,最常用的方法之一是确定不同组织中有价值的特定生物标志物的水平。生物标记是可以指示特定医学或临床状况的生物分子,包括感染,疾病的出现,功能不良/生物学功能良好的生物过程等。[14]。由于生物分子的智能特性,与化学指示剂相比,生物标记物具有更高的灵敏度,选择性,特异性和准确性。这些生物标志物可以成功用于不同疾病和恶性肿瘤的筛查,早期发现和预后。据报道,各种类型的生物标志物(蛋白质,核酸,代谢物等)目前在某些情况下是商业诊断试剂盒的共同目标[6, 15 ]。

根据其应用,生物标记可分为两类:诊断生物标记和筛选生物标记。诊断生物标志物的评估通常通过酶活性分析,探索抗原-抗体相互作用或检测可通过生物技术或生化技术(包括PCR,ELISA,FISH,IHC等)实现的特定核酸序列来进行[10, 16-18]。理想的诊断生物标记物应在区分疾病时提供高灵敏度,出色的特异性和令人满意的准确性。这些生物标志物还应具有研究药物功效和评估所选治疗结果的潜力,尤其是在癌症中[16, 18 ]。  另一方面,完美的筛查生物标志物应具有极高的特异性,减少假阳性错误,能够显示疾病的不同阶段,易于确定且无需复杂的医疗程序,而且价格合理。释放到体液(例如血液,唾液和尿液)中的生物分子是早期筛查急性和慢性疾病,传染病,遗传疾病和癌症的有益靶标[19-21 ]。

microRNA是最新,最可靠的生物标志物,可用于早期发现,诊断,转移,预后和治疗评估[22, 23]。在以下部分中,将简要讨论这些有价值的微小生物分子。

本文的目的是回顾医学诊断,生物传感器,电化学生物传感器的概念,并强调纳米技术在纳米生物传感器的开发和应用中的作用,以作为一种新的可靠的生物标志物检测技术在microRNA(miRNA)中应用。我们还总结了用于miRNA检测的电化学纳米生物传感器领域的最新思想和进展,并解释了重要的突破。

 

microRNA(miRNA)作为医学诊断的有价值的生物标记

微小RNA是一类小的非编码内源性RNA,长约22个核苷酸,可在转录后水平上负面控制其靶基因表达。自从1993年发现它们以来,miRNA的重要作用就经常在调节人类的不同基因[ 24, 25]。图1示意性地示出了miRNA的产生和成熟的步骤,以及其在基因调控中的功能模式。

由于miRNA参与调节重要生物学途径和细胞周期和凋亡等机制的关键基因,迄今为止,它们在健康和癌细胞/组织中的表达模式存在相当大的差异[22, 24]。此外,一大类miRNA被分类为“circulating 微小RNA”被释放到血液中,它们的表达水平与疾病阶段,肿瘤发生的开始,癌症的发展或转移[11, 26]。循环miRNA非常稳定,可以通过血液采样和随后的分子分析轻松评估。具有所有这些有利的特征,使得这些高度保守的分子成为用于医学诊断的理想生物标记[11, 26 ]。

设计和建议了许多用于miRNA定量的方法,其中包括实时qPCR,Northern印迹,微阵列和转录组的深度测序(RNAseq),由于它们的特殊优势,因此更可取[11, 28]。 Northern印迹法是1977年引入的最古老的方法,它包括基于大小的RNA样品分离及其与互补探针的最终杂交。由于该技术的灵敏度低,耗时且使用危险的放射性标记[29, 30]。由于基于微阵列的方法可以同时检查大量样品并获得海量数据,因此多年来一直受到人们的关注。尽管操作简单,但基于微阵列的分析已被视为定性技术,无法在miRNA定量分析中提供基本的敏感性[31, 32 ]。

最近,转录组的深度测序也已用于研究生物样品中的miRNA。 转录组的深度测序得益于用于并行分析的高通量技术以及探索所有带注释miRNA表达的能力[33, 34]。但是,该技术已显示出有望用于发现新型miRNA的应用,而不是用作诊断或筛选目的的简便定量工具。如今,实时定量PCR是用于miRNA评估的最常用方法。这是一种敏感的方法,即使在小型实验室中也可以提供多重分析[1]。近年来,已引入各种策略,例如使用茎环引物来优化此方法的miRNA评估[35]。但是,miRNA的小尺寸仍在区分miRNA前体和成熟miRNA方面限制了该技术。此外,实时qPCR通常被认为是一种依赖专家的先进技术,需要昂贵的试剂和设备[7]。基于常规方法的所有优点和缺点,基本上仍需要寻找可以快速进行廉价miRNA测定的更好策略。

微小RNA生物传感器的开发已成为过去十年中最有吸引力的研究领域之一。这种有趣的方法已经提出了许多生物传感系统,尽管存在很大的差异,但它们具有一些共同的关键特征[4]。在接下来的部分中,我们将讨论电化学miRNA生物传感器,并探讨它们由于与常用方法相比具有的显着优势而引起人们对精确筛选和早期诊断致死性疾病的希望。

 

用于miRNA定量的电化学生物传感器

根据IUPAC的定义,生物传感器是一种利用生物/生化相互作用来检测分析物的传感器。生物传感器通常由两个主要部分组成:生物识别元素也称为“bioreceptor”是与分析物相互作用的一种,由生物分子(蛋白质,核酸,PNA等),细胞受体,酶,细胞器,组织乃至整个细胞组成[5 ]。 This part is assembled with a physicochemical transducer that is responsible for converting the signal resulting from 生物受体-analyte interaction into measurable signal. The nature of transducer significantly influences the sensitivity of the biosensor and usually is the basis of biosensor classification [4, 36](图2)。

在各种类型的生物传感器中,电化学传感器因其令人印象深刻的灵敏度,与先进技术的高度兼容性,便携性和可负担性而在生物医学领域得到了更多的应用[3]。特别是,电化学方法的显着特征与核酸的高选择性本质的关联,导致制造出成功的生物传感器,可以检测所有类型的核酸[4, 6]。只要检测到特定核酸序列对细菌/病毒感染和污染的诊断确实有价值,这些电化学生物传感设备就可以有效地帮助生物医学,制药和环境应用。对于miRNA,精心设计的电化学分析有望使致命疾病的早期检测成为可能,从而导致更有效的治疗并改善患者’ quality of life [7, 9, 38, 39 ]。

根据换能器的类型和测量方法,电化学生物传感器可分为五个主要类别:电位计[ 40],电流表[41],伏安法[8],电导率[42],阻抗测定法[43]和离子电荷或场效应[44]。基于电导和阻抗的生物传感器通常被称为无标记电化学生物传感器,可以根据电极表面上电活性物质的行为确定分析物[45]。然而,如图3所示,伏安模式是最常用于定性和定量分析的电化学技术。在电化学miRNA生物传感器中,由于具有更高的灵敏度,循环伏安法(CV),差分脉冲伏安法(DPV)和方波伏安法(SWV)是最有吸引力的技术[ 7, 46, 47 ]。

在几乎所有的miRNA生物传感器中,检测程序都是基于miRNA靶标与互补探针的特异性杂交而完成的。探针通常用能够产生电化学信号的材料标记[48]。在另一种策略中,miRNA生物传感器是使用电活性标记(例如二茂铁硼酸[49], 亚甲蓝 [50]或oracet blue [9与单链相比,其显示出更高的插入双链核酸的趋势。因此,制造电化学miRNA生物传感器有三个主要步骤:1)将互补探针固定在电极表面上; 2)miRNA靶标与电极表面探针的杂交;和3)修饰电极的电化学分析[5, 7 ]。

尽管生物传感器结构的设计包括探针固定方法,生物传感平台和电极表面的修饰在制造电化学生物传感器中起着至关重要的作用,通常被认为是设备的识别特征。然而,目标也被认为是重要的部分,应该被筛选或衡量。图4显示了频繁miRNA被选作已报道的miRNA生物传感器的靶标。可以看出,miR-21是其中最常见的miRNA(32%),这可以解释,这是由于该miRNA在多种类型的恶性肿瘤中的既定贡献所致[51 ]。

此外,电化学miRNA生物传感器已被提出作为具有广阔前景的医学应用,但在医学应用方面前景广阔,但是,提高灵敏度,增加选择性,扩大线性范围,降低检测限,减小设备尺寸并促进便携性已得到了广泛应用。始终是满足[52, 53]。因此,已经提出了各种方法以达到理想的miRNA生物传感器。在许多电化学miRNA生物传感器中,已经报道了使用参与氧化还原反应的不同酶,而这些酶负责产生最终的电化学信号[54, 55]。在这些生物传感器中,酶的底物被添加到反应区作为探针的标记。值得注意的是,此类基于酶的生物传感器需要严格的优化条件,以便在生物传感器制造和电化学测量过程中保持酶的稳定和活性。56]。另一个想法是采用导电聚合物进行电极修饰。这些聚合物及其衍生物可以大大加快电子在电极上的转移,从而改善电极的电化学行为并放大检测信号[57 ]。  此外,在最近十年中,纳米材料在生物传感器技术中的参与为使电化学生物传感器小型化同时提高其分析能力打开了有趣的新大门[53]。下一部分将讨论纳米技术在电化学miRNA生物传感器构建中的巨大影响。

 

用于miRNA定量的电化学纳米生物传感器

近年来,纳米技术的进步已广泛地应用于生物传感器技术,尤其是电化学技术[53]。纳米技术被定义为在分子/原子水平上生产,制造和操纵材料以控制其特性和应用的潜力[58]。由于纳米材料(尺寸范围为1-100 nm)与块状形式相比通常显示出新颖且不同的光学,电,电化学和磁性性质,因此在生物传感系统的设计和构造中使用纳米材料不仅减小了设备尺寸,而且还减小了设备尺寸。为生物传感器增加了额外的有用特性,从而有效提高了生物分析结果的准确性和可重复性[58, 59]。显着的表面体积比和与生物分子相似的尺寸范围是纳米材料与生物标志物之间有效的非破坏性反应的原因[7, 53, 60 ]。

广泛的纳米颗粒,纳米棒,纳米线,纳米团簇,纳米复合材料等已用于电化学生物传感器制造中,用于miRNA测定(图5)。这些纳米材料主要参与电化学信号放大,生物分离和生物分子固定平台[52, 53 ]。  

表1总结了用于miRNA定量的电化学纳米生物传感器领域中的大多数最新进展。 该表确实包含纳米生物传感器的规格,例如检测到的miRNA,电极和电化学方法,机理,应用的纳米材料,动态范围和检测极限(LOD)。

关于电化学miRNA纳米生物传感器的最早研究之一发表于2006年,作者报告了使用电催化OsO2纳米颗粒进行信号放大[88]。检测程序从miRNA过氧化反应开始,以在3处生成二醛。′结束。在氧化的miRNA与预先固定在电极表面的探针杂交后,添加异烟肼修饰的OsO2纳米颗粒。最终测定是通过肼的氧化完成的。该生物传感器的检测下限估计为80 fM [88]。在Jolly等人的另一项研究中,已经开发出一种高灵敏度的双模式电化学平台来检测miRNA [89]。如图6A所示,首先用硫醇化肽核酸探针序列和6-巯基-1-己醇(MCH)修饰了金电极。与目标miR-145杂交后,已添加了带正电的金纳米颗粒,并通过使用硫醇化的二茂铁记录了方波伏安图。动态范围从1开始 fM to 100 nM以及0.37的检出限 据报道,该生物传感平台具有fM [89]。在Dong等人的另一项研究中,使用寡核苷酸封装的银纳米簇作为电化学探针,制造了miRNA生物传感器。该纳米探针在miRNA序列的特异性检测和有效的电化学信号放大中起着双重作用。银纳米团簇模仿了还原H2O2并产生最终检测信号的酶行为。该miRNA纳米生物传感器的线性范围为100 fM-10 nM,检测极限为67 fM [90 ]。