银杏叶提取物固体脂质纳米粒对雌性小鼠的配制,表征和毒性评估

文件类型:原始研究文章

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1 Pharm D., Pharmaceutical Sciences Research Center, Islamic Azad University, Tehran Medical Sciences University (IAUTMU), Tehran, 伊朗。

2 Pharm D, PhD, Department of Toxicology and Pharmacology, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Islamic Azad University, Tehran Medical Sciences University (IAUTMU), Tehran, 伊朗。

3 Pharm D, PhD, Department of Pharmaceutics, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Islamic Azad University, Tehran Medical Sciences University (IAUTMU), Tehran, 伊朗。

4 Pharm D, PhD, Department of Research and Development, Hakim Pharmaceutical Company, Tehran, 伊朗。

抽象

目的和目的:我们旨在提供GBE的固体脂质纳米颗粒(SLN),并根据最近发现的银杏叶提取物(GBE)对Covid 19和流感病毒的强抑制作用评估其口服安全性。材料和方法:通过扫描电子显微镜(SEM),原子力显微镜(AFM)和动态光散射(DLS)方法分析纳米颗粒的形貌和粒径。在下一步中,通过透析膜方法确定了85%负载SLN的释放曲线。根据OECD 425和OECD 407指南对雌性小鼠选定的具有适当稳定性的冻干制剂进行了急性和重复剂量的口服毒性试验。结果:球形GBE-SLN在最初的72小时内释放了GBE。在急性口服试验中,高达2000 mg / kg的剂量没有’不会导致死亡或任何毒性迹象。对三种剂量水平(0.5、5、50 mg / kg /天)的重复剂量口服毒性研究没有’t显示由于临床,生化和尸检评估而引起的任何异常变化,但血液学评估显示,高剂量(50mg / kg)动物组的肝脏,肾脏,心脏,肺和卵巢的某些异常变化导致凝血异常。结论:GBE-SLN的重复剂量口服给药最高剂量为5 mg / kg /天被认为是安全剂量水平。在适当的体外和体内模型中,以后的研究对于评估当前GBE-SLN对Covid 19的预防和治疗作用是必不可少的。

关键词


介绍

的 最初的中国树 Ginkgo biloba (银杏),是最古老且仍活着的树种之一,在世界范围内作为观赏树种植,但 已经确定了许多医疗应用 引起银杏叶提取物(GbE) 它在世界各地持续使用了几个世纪(1) . Nowadays 的主要成分 银杏叶提取物(GbE)包括 Ginkgolic acids (已经认识到几种2-羟基-6-烷基苯甲酸的混合物,萜品酸三内酯(银杏内酯A,B,C,J和银杏内酯)以及类黄酮苷(槲皮素和芦丁)(2)和 GBE对COVID-19的强抑制作用,对GBE有好处 有人建议包膜致病性病毒(3) . 

这种免费提供的保健食品的较早生产和广泛目的是在心血管和缺血性疾病(4),记忆力减退和认知障碍(5),癌痛(6),代谢综合征(7),血栓形成性疾病中GBE治疗价值(8)和性增强(9),但 最近的一项研究显示,银杏酸(GA)对多种包膜病原性病毒(包括单纯疱疹病毒1(HSV-1),人巨细胞病毒(HCMV)和寨卡病毒(ZIKV))融合具有稳定的抗病毒活性主要通过病毒融合抑制。此外,这些研究人员还发现GA具有通过次级机制抑制HCMV病毒DNA和HSV-1蛋白合成的潜力(3)。鉴于最近发现的对允许的细胞已确定的病毒感染具有强抗病毒活性的发现,GBE可能是可能用于抑制全身和局部药物制剂中的其他急性病毒感染(例如冠状病毒[(COVID-19),EBOV,ZIKV,IAV和麻疹)]。

随着人类广泛使用GBE并日益关注其在啮齿动物中的潜在毒性,美国国家毒理学计划对GbE样品进行了为期2年的口服研究,并通过基于该提取物的明显致癌活性证据明确了其肝毒性。小鼠肝细胞癌和肝母细胞瘤的发病率增加。尽管GbE被国际癌症研究机构归类为可能的人类致癌物(2B组) (10) , later STudies didn’t确认肝细胞有任何明显的遗传毒性或生物学相关的细胞毒性作用以及总基因表达变化 (11) 。为了克服有关GBE致癌作用这一有争议问题的挑战,一些研究发现GBE低剂量对基础氧化损伤和环境毒性物质(例如百草枯在体内和体外模型中诱导氧化DNA (12).2020年的一项最新研究表明,GBE剂量为50-150 mg / kg时对H的致胶剂作用具有保护作用2O2 的诱变潜力 H2O和H引起的氧化损伤2O2 通过改善生化和氧化应激以剂量依赖性方式显示GBE功效 (13) .

药物的被动扩散可能会受其亲脂性,大小,分子量和电荷的影响,但可用的GBE药物剂型的功效仍存在争议,因为GBE是一种强水溶性分子,组织渗透性有限,因此制备GBE固体脂质纳米颗粒(SLN)可增加这种小分子(药物)的亲脂性 基于这一概念,我们在本研究中旨在提供GBE的口服SLN制剂,以提高其生物利用度和稳定性,增加亲脂性和器官(肺)入口,并推迟其在体内的快速分解。为了达到这些目标,我们准备了口服GBE-SLN,并根据OECD 425和OECD 407指南评估了其急性和重复剂量的口服毒性。

材料与方法

材料

标准化的GB提取物(EGb761)由伊朗Darouk制药公司(伊朗德黑兰)提供,由陕西嘉禾植物化学生产。中国有限公司,含24%黄酮(HPLC)和6%内酯(HPLC)。胆固醇,硬脂酸,单硬脂酸甘油酯(GMS),甘露醇,氢氧化钠和磷酸二氢钾购自Sigma Aldrich(德国汉堡)。乙醇,丙酮和Tween 80(聚山梨酯)购自Merck Company的当地分支机构。

实验室设备’s

分析天平(美国俄亥俄州),0.02µm针筒式过滤器(斯里兰卡Biomed Scientific),数字pH计(SANA SL-901,伊朗),均质器(IKA,德国),超声波探头(FAPAN,伊朗),冷冻干燥器(SBPE,伊朗),加热搅拌器( SLNs的制备使用了德国HEIDOLPH公司和离心机(KOKUSAN公司的H-200NR型)。

紫外分光光度计(日本岛津市),动态激光散射镜(韩国QUDIX),原子力显微镜(AFM),双镜/光栅镜C26,DME,丹麦),扫描电子显微镜(SEM)(日立S4160) ,透析膜(D0405-SIGMA ALDRICH),差示扫描量热法(DSC)(热分析(TA),DSC Q10,Gavage注射器(伊朗Ara Teb。Fan公司)和Falcons(德国伊索拉)用于体外纳米粒子的评估,并为毒性测试提供最终配方所有实验室设备均由德黑兰IAUTMU的药物科学研究中心提供。

Ginkgo Biloba 固体脂质纳米颗粒s (GBE- SLNS)

亲脂相的制备

高剪切均质化方法与超声处理相结合可提供所需的配方。为了制备和比较7种初始制剂的脂质相质量,使用了不同百分比的胆固醇,硬脂酸和单硬脂酸甘油酯。将脂质成分分别转移到乙醇和丙酮的混合物中,加热并搅拌(500 rpm,60-50°C)直到脂质相完全熔化并在乙醇-丙酮混合物中消失(表1)。

水相的制备:

为了制备水相,在加热器搅拌器上将吐温80(2.5%w / w)添加到去离子水(50 ml)中以完全混合,然后将第一步的脂质相逐渐添加到水相中,并最终混合物将其均质化(10min,20000rpm)并超声处理(5min,70rpm)。将制备的纳米颗粒(NP)置于冰浴中(5分钟)快速形成并在室温下保存。离心法(4000rpm,3min)用于分离任何可能的NP聚集体,并进行DLS分析以选择尺寸最小,粒径分布良好且在一小时后最稳定的制剂。 在对安慰剂制剂进行初步研究后, 从上述程序中将EGb761添加到两种选定配方的亲脂相中,并进行粒度分析,ζ电势测定和物理稳定性测试。在以下条件下制备SLN时,可获得最佳的粒径和分布:500 mg胆固醇,1.5%w / w吐温80、50 ml水,12 ml乙醇,4 ml丙酮和125 mg银杏叶,均以20000 rpm的速度均质化。 10分钟,超声处理10分钟,最后以4000 rpm离心3分钟(表1)。通过差示扫描量热法(DLS)以及SEM和AFM对形态进行表征& size evaluation .

载药效率

如前所述(Haghighi P 2018),间接方法用于计算载药效率。简而言之,将所选择的制剂(制备后)离心(在温度为-4℃下以20,000 rpm离心40分钟),然后使用0.22的体积过滤分离的上清µ在过滤器注射器系统中完成。最后,紫外光谱用于确定分离溶液中的药物浓度。使用公式1(15)计算药物量。

(1)

药物释放

如前所述(16)使用透析进行释放调查

采用Do405透析管23.15mm(德国西格玛)的袋法。

实验动物和居住条件

在获得IAUTMU伦理委员会的编号为IR.IAU.PS.REC.1396.146的伦理委员会批准后, 该研究是在30只成年的定期循环雌性小鼠中进行的,它们的年龄为10周,平均初始体重为22.86(2.74)g,这些小鼠是从伊朗牧场研究所获得的。将雌性处女小鼠关在标准实验室室内条件下,在室温下进行12小时的明/暗循环(23± 2 °C)和相对湿度(20%),所有治疗组均可免费使用自来水和标准饮食。动物可自由获得标准的颗粒饮食和随意饮水,但计算直到研究结束为止的每日食物和水摄入量。按照标准执行笼清洁时间表,空气过滤和再循环,健康检查和设施维护操作规程,并记录下来。根据伊朗卫生和医学教育部关于实验动物的护理和使用以及CCAC关于实验动物的护理和使用的指南,圈养和维护动物。

急性和反复剂量口服毒性研究

为了确定LD50范围,实施了OECD 425。为了这个目的,使用了10只小鼠(5只雄性和5只雌性,年龄8-12周,体重20至24g)。他们被关在笼子里5天以适应实验室环境。在这段时间内,提供了足够的水和动物饲料。动物禁食1 –GBE-SLN管理开始前2小时,可免费取水。选择用于动物的急性毒性评估和确定LD50的口服剂量为2000 mg / kg,将其作为单次剂量服用。在管饲之后,对动物进行了完全观察,尤其是在给药后的最初30分钟至4小时内,并对其行为进行了监测。同样,对它们进行长达24小时的监测,然后每天进行治疗,直到第14天。在死亡或异常症状的情况下,会充分记录动物的信息和观察结果,并出于道德考虑将小鼠处死。在这项研究中,目的是观察动物在短时间内暴露于高剂量药物后的异常体征和死亡率。

为了进行重复剂量的口服毒性研究, 随机选择20只健康的雌性小鼠(每组5只雌性小鼠),并分为4组(3种治疗和媒介物对照组)。治疗组接受的每日剂量分别为0.5 mg / kg(低剂量),5mg / kg(中剂量)和50mg / kg(高剂量)GBE SLN,剂量不超过1 ml / 100 g BW /小鼠。每周7天进行管理。对照组动物灌胃同等体积饮水,用于治疗组。

每天观察动物的总体行为,并且在每天给药之前,每天在相同的常规时间称重雌性小鼠。每天测量一次饮水量,食物消耗和体重。 根据OECD 407毒性评估指南(OECD指南,TG 407,2008), 总体重,器官重量,宏观器官评估,血液学,血清生化和 organ 在进行28天研究后评估组织病理学。在第29天 ,在轻度二氧化碳麻醉下,通过心脏穿刺麻醉两组小鼠的血液。他们全血的一部分保存在-80酸洗过的冷冻管中°C,将剩余的血液在3000离心×g / 10分钟在4的冷藏离心机中°C分离血清,然后保存在−80 °C直到生化分析。

组织病理学检查:

During necropsy STudy, all necessary 器官s including liver, kidney, spleen, heart, lung, brain, uterus and ovaries were dissected out. 的 whole 器官s weighted and fixed in formaldehyde 10% for 24 h and 日en embedded in paraffin blocks, sliced into 5-μm切片并用苏木精-曙红(H&E)用于组织病理学评估。由专业动物病理学家在光学显微镜下(Olympus BX-51; Olympus,东京,日本)检查切片并评分。

统计分析

在此分析中,将治疗组和对照组进行了比较。当方差没有显着差异时,通过单向方差分析(ANOVA)和学生分析数据’t检验。使用逐步多重比较程序来识别彼此显着不同的样本均值。只要通过方差分析(Anova)发现三个或更多样本均值之间存在显着差异,便使用事后检验。数值表示为均值±标清重要性级别设置为 p <0.05。所有统计方法均由SPSS 21版执行。

结果

GBE-SLN逐步配方和表征

第1步: 在准备了最初的7种初始纳米制剂并基于粒度分析之后,选择了制剂B1和B6作为阶段2中其余操作的最佳载体。

第2步: 通过GbE(API)加载基本配方,将次要配方(S1和S6)视为下一个Zeta电位和多分散指数(PDI)分析的主题。在此步骤中,由于S6比S1(2.92  -3.57 mV)尽管粒径较小(69.3  105 nm).

第三步: 在配制的第三步中,吐温80的百分比从2.5%w / w /降低至1.5%w / w,这使得在最佳条件下(Zeta电位:-7.12mV,PDI:0.336,和粒径:95.2nm)。

步骤4: 在下一个阶段(阶段4),超声处理时间从10分钟减少到2分钟,并且此操作导致较小的粒子具有更高的稳定性(F2:Zeta电位:-8.20mV,PDI:0.361,粒径:85.3nm )。

步骤5: 在上述程序的最后阶段,我们尝试向F2加载更多的API(200 mg而不是125 mg),但是增加的API水平使得F3配方中的颗粒更大(85增大至172nm)。基于这些逐步的配方,我们使用冷冻干燥法来稳定最佳配方(F2)(表1)。

GBE-SLN版本简介

根据用于F2制备的最佳包封效率,该制剂用于GbE的释放曲线研究 向我们展示了最佳的包封效率。为了达到这个目标,并准备好F2 SLN样本后, 制剂F2的纳米颗粒 将其转移到透析膜中,并在特定的时间间隔进行采样,并且该实验重复3次。根据获得的数据(表2),在72小时内观察到GbE释放的峰值。此后,API释放速率下降并达到恒定水平(图1)。表2说明了冷冻干燥后GbE的累积释放百分比。

GBE-SLN形态

我们使用SEM(图1)和AFM(图2)分析来评估冷冻干燥前后(F2)的新鲜悬浮剂型中优化配方的形态  F4)。图1和图2与DLS结果非常吻合(表1)。在与冷冻干燥样品的图像相对应的图1c和1d中,颗粒尺寸较大并且颗粒均匀性也降低。

GBE-SLN差示扫描量热法分析

DSC热谱图表明最终配方中材料的焓变和比热容。每种化合物的峰如图3所示。GbE峰在72.56处获得° C and 163.64°C,胆固醇为163.27° C and 204.91°C,甘露醇,164.38°C.将三种物质合并后,在166.5处出现一个峰°C和冷冻干燥的制剂,在165.7处看到一个峰°C.由于GbE和胆固醇中各组分的结构,形成氢键的可能性证实了本研究中最终制剂的缓慢释放曲线。

GBE-SLN急性经口毒性

的 result suggested 日at 日e LD50 of GBE-SLN is greater 日an 2000 mg/kg body weight. 的re was no signs of toxicity or mortality, no significant change in body weight, 器官 weight, tissue macroscopic shapes and colors, behavior, renal function test, liver function test and lipid profile after 24 hour from single dose administration as well as 14 days from 2000mg/kg of GBE-SLN oral administration in both genders.

GBE-SLN重复剂量口服毒性

临床

在为期28天的雌性小鼠研究中,未观察到死亡率,或每日口服剂量最高50 mg / kg的任何常见的过量用药并发症。所有动物的体重,食物和水的摄入量均显示正常,没有任何可观察/可记录的临床变化。用GBE-SLN处理的大鼠从1开始未降低饲料消耗ST 至研究的第4周,但与媒介物对照组相比,高剂量(50 mg / kg /天)治疗的GBE-SLN的平均总体重显着增加(36.53(1.92)  34.26(1.25)g, p= 0.023)(表3)。

尸检

在研究28天后,使用GBE-SLN剂量和媒介物对照治疗的小鼠未见明显异常变化。除了高剂量GBE-SLN处理的小鼠的平均肝脏重量相比,媒介物对照组显着降低[1.44(0.10 1.48(0.18g), p=0.027]. 的 mean weights of other 器官s including heart, brain, kidneys, liver, lungs, uterine, ovaries and spleen in 3 different doses remained unchanged compared to vehicle control group (Table 3).

血液学

高剂量GBE-SLN处理的小鼠血液学变化异常。与媒介物对照相比,治疗组MCV水平显着升高[54.93(2.12) VS 52.15(1.57)fL,p = 0.015]。与媒介物对照组相比,GBE-SLN处理的小鼠中MCV以外的其他动物PLT明显增加[1041.90(196.73) v.s 831.83(147.85), p= 0.041]。高剂量治疗组的其他血液因素在第28天保持不变(表4)。在该重复剂量口服毒性研究的第29天,所有血液因子在中低剂量时均保持正常。

血清生化

如表5所述,与媒介物对照组相比,在所有三个GBE-SLN治疗组的小鼠中,天冬氨酸转氨酶,丙氨酸转氨酶,碱性磷酸酶和所有其他生化毒性相关因素均未改变(p<0.05)。经处理的所有动物的脂质分布也保持不变(表 5).

组织病理学

显微评估显示GBE-SLN组(图4A1、4A2)和媒介物对照组的脾脏部分正常。

与高剂量(50mg / kg /天)治疗组(图4B2)相比,GBE-SLN组中三分之二的雌性小鼠的肾脏切片显示正常(图4B1),但在一只小鼠的肾脏中观察到轻度充血(图4B2)。车辆对照组(图4B3)。

Despite normal feature in lung sections of most of female mice in GBE-SLN group (Fig. 4C1), one mice in 高剂量组 showed focal Hemorrhage (Fig. 4C2) compared to normal feature in vehicle control group (Fig. 4C3).

心 sections of most of female mice in GBE-SLN group showed normal feature (Fig. 4D1) but mild congestion was seen in 日e heart of few cases of 高剂量组 of animals (Fig. 4D2) compared with vehicle control group (Fig. 4D3).

尽管在动物肝脏切片中未检测到任何脂肪变化,但高剂量(50mg / kg /天)的GBE-SLN动物表现出轻度的液泡变性和单核细胞的局灶性浸润(图4E1),门静脉单核细胞的浸润和肝细胞坏死在中等剂量(5mg / kg /天),低剂量(0.5mg / kg /天)和对照组中,与正常肝外观相比(图4E2)和髓外造血(图4E3)。

GBE-SLN组的雌性小鼠解剖后的大脑几乎没有在脑组织中显示局灶性胶质增生(图4F1)。在中等剂量(5mg / kg /天),低剂量(0.5mg / kg /天)的情况下,与正常脑部特征相比,病例的皮质层细胞形态的示意图变化(图4F2)也是GbE暴露动物的第二个异常特征。 )和对照组(图4F3)。

子房

高剂量GBE-SLN组的所有雌性小鼠的卵巢均显示黄体和肛门卵泡(图4G1)和肛门前卵泡(图4G2),中剂量(5mg / kg /天),低剂量(0.5mg / kg) (kg /天)和对照组显示出正常的卵巢组织,在不同的阶段有许多卵泡(图4G3)。

子宫

在显微镜下评估,所有治疗剂量和对照组子宫均正常(图4H1、4H2、4H3)。

讨论

固态脂质纳米颗粒(SLN)是新型胶体药物载体,与聚合物或无机纳米颗粒相比具有生物相容性脂质纳米结构,可控制药物释放速率并改善任何药物分子的持久作用(Solmaz Ghaffari 2011)。与其他新型药物递送系统(NDDS)相比,SLN的另一个优势之一是它们的脂质性质和小粒径,即使没有必要的功能化,也可以使其从生物屏障中渗透。这些规范使SLN成为基于脂质的纳米系统最具吸引力的代表之一,具有在不同疾病中靶向药物递送的巨大潜力(Christos Tapeinos 2017)。基于此概念,我们在本研究中决定提供GbE–用于在Covid 19中未来应用的SLN,并评估GBE-SLN在急性和重复剂量口服毒性模型中的安全性。据我们所知,由于载药量不足,缺乏抗药性,很少有基于草药的SLN被临床开发用于商业应用。疗效和未知毒性。

在进行毒性评估之前,我们通过修改脂质的类型和水平,表面活性剂的水平,均质化的时间和速度,超声处理的时间以及药物与脂质的比率,设计了尺寸最小,具有最佳PDI的纳米颗粒。我们跟踪了任何提及的变量(单独或组合)对粒径,PDI和zeta电位的影响。下一步,选择高剪切均质化技术,通过逐步调整几个因素来提高优化脂质载体的负载能力公式。基于我们提供GBE-SLN的最初经验(Haghighi等人2018),我们证明了许多自变量的合理性以改善因变量,最终配方中,乙醇/丙酮的比例,活性剂/脂质的比例,均质化和超声处理条件和表面活性剂的百分比完全不同。在配制具有最佳负载量的缓释GBE-SLN的成功努力和令人兴奋的成就的同时,头20分钟的释放率为7.51%,72小时内达到峰值释放(85.28%)的能力,已经表明释放曲线与粒径和其他研究变量无关。在本研究中,GbE的SLNs的药物释放曲线与我们之前的研究相似,因此似乎可以与API相互作用的脂质载体类型是药物释放曲线的主要有效变量,尽管可以完全确认基于这一假设,应在下一步扩大研究中设计更多的研究。

在本研究的第二部分中,我们评估了GBE-SLN在三种不同剂量水平(0.5.5。50mg / kg)的小鼠模型中的急性和重复剂量口服毒性,因为GBE-SLN的口服毒性可能与基于药代动力学变化和不同生物分布的常规GBE。对标准GB提取物(EGb761)的急性毒性研究表明,经口服途径(17)在小鼠中的LD50值为7700 mg / kg(ppm),这与我们对GBE-SLN的急性口服毒性相一致,没有任何毒性或死亡率的迹象根据OECD 425的指导原则,两种小鼠的剂量最高可达200​​0mg / kg。

在4个剂量组的20只小鼠均存活的情况下,在重复剂量的口服试验中,小鼠的平均体重。 high dose group 略有增加,但在28天雌性小鼠模型(OECD 407)中关于GBE-SLN的口服毒性的主要发现(包括临床体征和症状,水和食物消耗以及尸检和生化记录)没有’t显示出与类似剂量(50mg / kg /天)GbE的最新研究一致的任何异常情况 (13)。尽管在GbE的毒性评估中,以前的研究表明,对GbE暴露的动物的肝脏,甲状腺和鼻子有不同程度的影响,这在其性别,物种和暴露时期上是一致的 (18). We didn’不考虑我们研究对象的鼻子和甲状腺中的GBE-SLN毒性潜能,但肝脏重量减轻(p = 0.027 *,表3),轻度液泡变性,单个核细胞的局灶性浸润,肝细胞坏死和髓外造血。 GBE-SLN雌性小鼠(图4E1-3)是剂量依赖性肝毒性的可靠标志,即使在纳米制剂中也证明了银杏叶提取物具有肝毒性作用。幸运的是,较低剂量的GBE-SLN(0.5和5 mg / kg /天)消除了治疗大鼠的肝毒性风险,可在其抗病毒特性的下一个研究中考虑使用。

Mild congestions in 日e tissue sections of heart and kidney of animals were 日e other GBE-SLN induced 器官 toxicities which were observed in 高剂量组 of female mice (Fig 4 B2 and D2) .These observations were accompanied by some hematological disorders which explained in Table 4 .We found mild primary 日rombocytosis and increased MCV levels in GBE-SLN group of mice [1041.90103/μL(196.73)PLT与831.83103/μL(147.85), p = 0.041]。凝结是一种针对任何类型的出血的天然保护作用,我们在口服28天后同时在高剂量GBE-SLN处理的小鼠中发现了肺出血。先前已经描述了通过诱导过渡上皮和呼吸上皮增生以及大鼠嗅上皮中的萎缩,化生,神经萎缩和色素沉着对GbE呼吸毒性的发生率。 (19) GBE-SLN并未在我们的实验中检测到这种情况,但我们描述了伴随的血液学和肺部疾病对GbE可能的出血作用。这些偶尔观察到的剂量高于50 mg / kg / dar不能支持GBE-SLN作为凝血酶的有效抑制剂对血栓形成的益处,最近有人建议将其用于银杏叶中的黄酮类化合物。 (8),但是在未来的小剂量研究中可能会出现这种情况。其他组织病理学改变,例如心脏充血,肾脏充血,脑胶质增生,脑部异常细胞改变以及缺乏卵巢的卵泡发育,我们在图2中提到。图4是Gb-SLN的其他可能的剂量依赖性毒性反应,我们在本研究的少数情况下以50mg / kg /天的剂量观察到。这种广泛的Gb-SLN诱导的器官毒性反映了GBE-SLN的总生物分布,但我们记录了本实验在相同环境下较低口服剂量(0.5-5mg / kg)中Gb-SLN的总安全性。

许多研究表明GbE成分主要是类黄酮,萜内酯和银杏酸对血管新生的抑制作用 (20) 与同等严重的流感病毒感染相比,Covid-19的肺病理学特征显着 (21) 。 GBE拮抗血小板活化因子(PAF) (22) 在病毒感染(例如艾滋病毒)的流行中具有关键作用 (23) 而且GBE具有很强的抗氧化作用 (24) 这是另一种有效的针对Covid -19危机的治疗策略 (25).GBE调节兴奋性氨基酸的释放 (26) 和降低人类研究中的白细胞介素6细胞因子水平 (27) 对Covid-19临床症状和体征具有极好的预后价值 (28)

基于我们在当前动物研究中对GBE-SLN剂量高达5 mg / kg /天的一般安全性和系统耐受性的经验,我们强烈建议评估目前剂型通过人类研究对Covid-19危急危机的有效性。 GBE-SLNs可能对自由基毒性具有类似的保护作用 (13) and brain disorders (29) 在较低剂量下不会产生不良健康影响,如先前在临床前和临床环境中所述,常规剂量下不良健康影响最小 (9) 此外,给予Gb-SLNs的吸入疗法可被视为Covid -19的另一种有效策略,并进行了必要的临床评估。

我们从银杏叶中选择的纳米配方没有’t在急性和重复剂量28天研究中显示出任何毒性迹象,剂量最高可达5 mg / kg / day,强调了临床,血液学,生化,尸检和组织病理学,这表明它可作为Cocid-19诱导的全身性药物的有希望的补充和呼吸道症状。考虑到动物肝脏的组织病理学观察和轻度毒性反应以及暴露的小鼠对脑,肾,心脏和卵巢的部分毒性作用,我们将5mg / kg /天视为GE-SLN的未观察到的不良反应水平(LOAEL)并且我们建议根据GB的机械评估和Covid-19的致病特征,对该纳米制剂进行进一步的随机临床试验,作为针对Covid-19和其他病毒感染的新安全策略。

致谢

作者感谢伊朗达鲁克(Iran Darouk)为这项研究提供了API(银杏叶)。我们也承认 哈基姆制药公司药物科学研究中心的工作人员和负责人 以其出色的技术支持。目前的研究是Arezou Jammanesh博士的Pharm D.论文,该论文得到了技术上的支持 伊斯兰阿扎德大学,德黑兰医学科学大学(IAUTMU)和德黑兰–Iran.

利益冲突

作者声明在当前工作中没有利益冲突。

缩略语表

AFM原子力显微镜

API活性药物成分

CCAC加拿大动物保健理事会

DLS动态光散射

GBE银杏叶提取物

GBE-SLN银杏叶提取物–固体脂质纳米颗粒

H&E Hematoxylin-Eosin

IAUTMU伊斯兰阿扎德大学,德黑兰医科大学

50%人口的半数致死剂量

NDDS新型药物输送系统

NOAEL未观察到不良反应水平

NP纳米颗粒

OECD 的 Organization for Economic Co-operation and Development

SLN固体脂质纳米颗粒

SEM扫描电子显微镜

TG测试指南

 

 
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