小鸡胚胎提取物和金纳米粒子的协同作用,以匹配皮瓣再生

文件类型:原始研究文章

作者

洛尔斯坦医科大学医学院解剖学系,伊朗伊利诺伊州霍拉马巴德。

抽象

背景与目的:本文研究了金纳米颗粒(AUNPs)和小鸡胚提取物疗法(CEET)对促进伤口愈合特性的影响,该特性与皮瓣再生的动态愈合过程相匹配。
方法:使用掺钕钇,铝和石榴石光烧蚀法的高强度短脉冲光束模式开发了AUNP。还有45-µ来自4-6天的鸡胚的1μg提取物用作CEET的蛋白质来源。在四十五只白化Wistar大鼠中产生了背侧随机皮瓣(RSF),它们被随机分为三组; GC);组未接受任何治疗(对照组),G(AUNP);仅用AUNPs和G(CE + AUNP)处理的大鼠用AUNPs和CEET处理。在随机的皮瓣动物模型中,AuNPs和CE被用作解决方案,可方便地输送到皮瓣中。接下来用摄录机评估皮瓣的存活率,并在苏木精手术后第3、6和9天进行组织研究。&曙红和Masson三色染色。
结果:用AUNPs和CEET治疗的大鼠的皮瓣存活率显着高于其他大鼠。组织研究表明,在伤口愈合的初始阶段,AUNP和CEET诱导了新血管的形成并刺激了引起炎症的反应。
结论:将AUNP与CEET结合使用可增加皮瓣再生的动态恢复潜力。

关键词


介绍

受伤的组织修复也可能是一个活跃而复杂的过程。在皮瓣愈合的主要阶段,组织在繁殖阶段会因压痛,血液和氧气供应不足而受损,从而损害细胞的稳定性和死亡。当内皮相关细胞显示出足够的血液发育时,这些细胞可以快速繁殖,而胶原蛋白产生的细胞和间充质相关的干细胞则可以促进新生和更新[1]。最后,在修复阶段,组织经历了其形式和与动脉相关的系统的重建和发展,其结果是,其在数月或数年内恢复了正常的性能。提出了几种伤口治疗方法,即药物疗法[3],细胞疗法[4],体外冲击波疗法[5]和负压伤口疗法(NPWT)[6],外源性因子刺激疗法[7]也作为蛋白质。治疗[8]。生长因子在细胞之间运输信号,以诱导细胞向特定环境繁殖或定向迁移,从而导致ECM的发展和新血管的形成。鉴定胚胎器官组织提取物中的成纤维细胞生长因子(FGF),因此将其存在与特定发育事件相关联是该蛋白在器官发生中的一项任务[9]。重要的成纤维细胞蛋白在创建的组织中似乎广泛繁殖,这已通过生化和组织浸出液的免疫学检查得到证实。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)由类似于鸡胚绒毛尿囊的活生物体组织提供,是外源性的,适合增强血管生成。体内或体外详细考虑了小鸡胎儿游离修复修复的大量积极成果[10]。小鸡胚胎提取物疗法(CEET)可以增加细胞置换,减少细胞死亡,诱导新血管的形成,在最小的血管中重建血液循环,还可以改善损伤的愈合[11]。大量的活性氧会导致氧化作用扩展,从而损害复兴进程。因此,已经假定抗氧化剂操作剂降低了氧化水平并破坏了损害修复的活性氧,从而损害了损害。 ROS是细胞消化系统的动态副产物,具有细胞信号通路的功能[13]。但是,活性氧和有机分子的大量结合会损害脱氧核糖核酸,核糖核酸,蛋白质,细胞功能,也限制了其发展[14]。 例如,在意外皮瓣再生的第一阶段,局部缺血会导致皮瓣供氧不足,阻塞后血流恢复和压痛,尤其是在远离躯干的部位。氧气供应不足的不利条件阻止了襟翼在主要阶段快速重建。一种称为纳米材料的抗氧化剂是一种金属材料,它利用指标,基本特性及其作为抗氧化剂的实现方式。这种纳米材料最近引起了研究人员的关注。人们认为,在药物输送,再生医学和成像等情况下,纳米医学已被广泛使用[15]。 金纳米颗粒(AuNPs)令人着迷,因为它具有新的特征,例如与尺寸相关的电[16],光学[17],合成诱人的特征,可能对自然目的有价值[18]。AuNPs具有很强的抗氧化作用。可以消除DPPH,亲羟基,H2O2和NO等自由基[19]。 金纳米颗粒中有关自由基的氧化抑制作用完全取决于确切的表面[20]。  球形金纳米粒子有一个超大区域,该区域在高倾斜度中包裹起来,可以有效地识别带负电荷的亚原子粒子和活性氧物种的衰老或关闭。因此,AuNP被认为是强大的抗氧化剂,在伤口愈合中具有重要作用[21]。 However what isn’承认,与诸如胚胎器官之类的生长因子类型有关的纳米粒子的前景。因此,本研究旨在评估45暴露于治疗性AuNPs和CEET的大鼠模型中皮瓣修复的主动恢复方法的结果µg.

材料与方法

动物

在本研究中操作了45只体重为250-250克的白化Wistar大鼠。在控制光照(光照周期为12小时),温度和湿度的房间中,将大鼠同时置于单独的塑料笼中,并根据需要为它们提供特殊的饮食和水。该研究已由LUMS批准,其道德规范为IR.LUMS.REC.1397.096。

金纳米粒子(AuNPs)的合成 

在金片上(纯度为99.99%)执行支持激光烧蚀的程序。在激光辐照之前,将金盘浸入Branson高频压力(声波)清洁器中20分钟,因此,在20分钟后将金盘清洁。

为防止有机物相互作用,使用丙酮冲洗了金盘。对于球形金纳米颗粒的组装,通过在十二烷基硫酸盐溶液中通过激光对金圆盘进行激光烧蚀来制备C12H25SO4Na。在上述工作中,使用了Quanta-Ray GCR-170 Nd:YAG激光器(波长657 nm;脉冲时间间隔:10µ的持续时间和10 Hz的重复速度)。光消融22分钟后,溶液颜色变成朱红色,表明存在AuNPs [22] .

评估方法(DLS和Zeta电位)

动态光散射(DLS)用于分析AuNPs分布的大小。 DLS方法在溶剂中使用布朗运动纳米颗粒(NP)来测量其尺寸分布。激光投掷到颗粒中并在特定方向观察散射光,可以分析NP尺寸分布。 Zeta电位还与直接与NP迁移率相关的各种理论(Smoluchsky或Huckel)有关。使用多普勒电泳激光技术,对NP进行测量以确定其运动性(法国,Cordouan Technologies Company,Genesis)。

提供EE和Bradford蛋白测定

产卵的鸡蛋(平均质量为60克)由一个交易的养鸡场(Toyoorbarekat,伊朗)提供,并在正常情况下(热度和水蒸气浓度为37.5摄氏度,水温为65 %,相应地,每小时进行一次调整),直到使用完为止。在孵化4、5或6天后,意外地选择了卵并将其封闭以获取其内含物。通过均质装置(Qiagen GmbH,Hilden,德国)将每个样品两百微升在PBS溶液中均匀,然后以每分钟两千转的速度离心十分钟。通过添加较弱的溶液来分析蛋白质,聚集在沉积物上的液体被收集并变弱了十倍。如果鸡胎儿的生物学相关动态成分含量最高,则选择其后使用。将鸡胚中含有细胞成分的悬浮液冻干于−80摄氏度,并保持在−70摄氏度提取蛋白质并进行其他动物试验。鸡胚提取物中的蛋白质含量是按照Bradford蛋白分析法测量的。 CEE蛋白由595 nm处的吸光度读数定义,以牛血清白蛋白(BSA)为标准[23]。

在动物中创建随机的皮瓣

通过输注10 mg / kg的KTX(2.5 ml的氯胺酮,12.5 ml的氯胺酮,甲苯噻嗪类似物)麻醉每只大鼠。使用无菌刀片剃除后毛。 1.5×在大鼠的背部内形成5厘米(1:3)的随机皮瓣。然后,将45只大鼠随机分为3个治疗类别:由于G(C)安慰剂A(Aunp)接受了AuNPs的局部治疗,因此该大鼠未接受任何治疗。 G组(Aunp + CE)接受了包括CEE在内的AuNP治疗。考虑零工作日。在G组(Aunp)中,使用移液管将0.1ml的AuNPs溶胶施加于皮瓣,因此将大鼠置于单独的笼子中。在组G(Aunp + CE)中,将0.1 ml的AuNPs溶胶倒在皮瓣上,并给予10分钟以使AuNPs纳米颗粒渗透到皮瓣床中。 45µ在替换主要位置的皮瓣之前,先将g CEE注入身体的外壳中。治疗仅在第0天进行,因此,在术后9天对动物进行了临床检查[24]。

快速生存区评估和抽样

每天使用佳能EOS 1200 D便携式摄录机对治疗结果进行评估。皮瓣存活的面积用光分析仪(图像1 / 46r,NIH,美国)计算。每个治疗班中有5只大鼠被屠宰并尸体ʼ 在第3、6和9天收集外部覆盖的组织用于评估组织研究。将外部覆盖的组织在室温下置于10%NBF中三天。然后,将它们剃刮,冲洗,并通过增加乙醇含量(50%,70%,90%和100%)除去水,然后用二甲苯酚清洗并放在石油蜡中。使用切片机从外壳上制备3毫米的切片,并用HE染色剂和TRI染色。使用便携式摄录机(MU035),由光学显微镜(LM)(Leica Germany)看到幻灯片。[25]

统计分析 

结果以平均值表示±使用8.0绘图垫棱镜的标准误差。使用t检验的两组之间或使用单向ANOVA进行的两组以上之间的统计比较。当P时结果比较被认为是重要的< 0.05. 

结果

AuNPs(图。 图1a)以强度和颗粒数表示金。 DLS测试样品与SBL分析一起显示。

图表分析(图1(b))显示了金NP的平均颗粒尺寸,其尺寸分散最薄。

CEE中的总蛋白浓度为32.21µ克/毫升它是从4、5、6天大的胚胎中分离出来的。与对照组相比,Aunp + CE组的生存面积率一致性显着提高。 AuNPs胶体与CEET混合使用可动态修复皮瓣再生过程。测试组的皮瓣成活率的结果显示在  图2. G(Au)和G(Aunp + CE)2组的皮瓣存活率和组织存活率均高于未干预组。在研究阶段,在治疗类别G(Aunp + CE)中发现了最高的生存面积,这是对照组的约1.25倍。在第3、6和9天对苏木精-曙红和三色染色后,对皮肤活检进行光学显微镜观察(图3和4)。在第三天,在所有治疗类别中均稳定形成皮肤基质,即表皮的狭窄基质(图3(a),(b)和(c))。在G(Au)和G(AuNPs + CE)治疗类别中,进展的血管得到了进一步修复。

该组中有大量存在血管的成纤维细胞(Aunp + CE)并被收集。如图3(b),(c)所示,这些新形成的血管通过有组织的微观网络连接。

G(Aunp + CE)组中炎症细胞的渗透在第三天值得注意,尽管该组(金NPs)和对照组的渗透性较弱。在共济会三色玻片中,在伤口中央部位的对照组中观察到了令人满意的胶原蛋白表达(图4(a)),而在G组(Au)中观察到了皮瓣内的薄胶原蛋白(图4( b)。在G组(Aunp + CE)中,检测到厚胶原蛋白,如图所示(图4(c)),其在伤口中心显露出来;在第6天,AuNPs的影响小于使用CEET的AuNPs。 ,这在伤口愈合较慢和在肉芽组织中的适度渗透中表现出来(图3(b)),而伤口的上皮形成是使用金纳米颗粒和CEET完成的(图3(c))。另外,对照组和用G(金纳米颗粒)治疗的对照组也观察到严重的炎症反应(图3(d),(e)),但在G(Aunp + CE)中,组稍有减轻在第六天,对于G(Aunp + CE),键合基质形成不均匀,因此卵泡,毛细分泌腔和脂肪基团的细胞形成。此外,从骨干的最低点到最高点都可以看到致密的胶原蛋白(G级(Aunp + CE))(图。 4(F))。在第9天,所有组在皮瓣区域内均显示良好,并且组织结合再次不规则地形成。但是,用AuNPs(包括CEET)处理过的伤口是皮肤分类良好的皮肤,并且达到了出汗性能,形成了毛囊,因此胶原蛋白的体积过大,’与其他组相比位于襟翼内。显微镜观察显示,与仅接受金纳米管治疗的患者相比,接受AuNPs治疗的组(包括CEET)对动态皮瓣修复方法的效果最佳。

5.讨论 

 细胞信号传导中包含的一种能抵抗强力病原体的介质是低水平的ROS [26]。 在任何情况下,最上层的ROS都会通过抑制发育最终阻碍伤口恢复的愈合过程,造成细胞伤害,并在缺乏新生血管的情况下关闭[27]。 通过减少活性氧的程度,通过抗氧化剂的接近来定期促进伤口愈合。金纳米颗粒具有神话般的氧化抑制功能,包括生物相容性,出色的表面反应性以及无毒。这样,它’出于恢复目的,这些信息被传达给了人们可以想象的结果。 BarathManiKanth等人使用AuNP来溶解金NP对肝脏,肾脏和Pulmo内人体部位的毒性。在进行处理的人体器官中未观察到与形式相关的显着变化,并且将蛋白质的消化系统归一化以重新调整活性氧种类的收集并改善细胞功能。研究人员发现,金纳米粒子具有抗炎,抗氧化,抗微生物和抗血管生成的功能,可在损伤改善过程中增强胶原生成细胞的扩增并减少细胞死亡[28]。一些研究检查了金纳米粒子的结果和其他在糖尿病患者局部使用的氧化抑制操作者[29]。金纳米颗粒的局部使用通过对炎症的反应从本质上加快了康复的过程,并激活了未使用的静脉以形成分泌中的静脉。另一项可比较的工作是在啮齿动物模型中利用覆盖的金纳米颗粒治疗皮肤损伤[30]。他们表明,与其他同类相比,治疗组的创伤愈合速度高出四倍。此外,接受金纳米颗粒治疗的患者的胶原蛋白,VEGF,Ang-1和Ang-2的表达有极大的增加,这表明金纳米颗粒治疗可在损伤恢复期间加快新血管的形成,这与我们的研究一致。研究表明,两种金纳米粒和纳米粒疗法可加快生存期,并在第三天积极影响新血管的形成。蛋白质提取物由于鸡胚中支持康复的功能成分而被激活。在胚胎组织的提取物中鉴定出酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF)和bFGF,这表明这些生长因子也可能参与发育过程的调控。胚胎脑中FGF(aFGF样24 ng / g; aFGF和bFGF:18 ng / g)和肾脏(aFGF:25 ng / g)的存在与这些组织的血管形成有关。这通常是基于FGF在体内模型系统中众所周知的血管生成活性[31]。 AUNP和组织的通讯可能仍然受众多因素的困扰,例如血小板衍生蛋白(PDGF), 碱性成纤维细胞生长因子和(EGF)在局部治疗糖尿病引起的脚疮[32]。

 生长因子不仅完成损伤的康复。它们还主要有助于组织保守,因此也有助于细胞内信号转导的持续[33]。在过去的思考中,发现CEET非常适合以6的剂量刺激干细胞×将109个骨髓间充质干细胞(BMMSC)悬浮在1.0mL DMEM中。随后,在应用AuNP的同时,利用相同的CEE功能诱发损伤。 CEET对降低服务器,反应[34],细胞运动和产生角蛋白的表皮细胞的增殖具有关键的诱导作用。另外,CEET可以通过减少发炎细胞的作用或诱导氧化抑制酶的作用来减少活性氧的组装,从而重新调节氧化应激[23]。研究人员报道,即使微量的生长因子也会影响细胞的功能。通常通过将特殊的生化信号通过特殊的壁受体发送到特殊的触发细胞来完成[35]。生长因子通过与触发细胞中细胞膜上的特殊受体结合而刺激多种活性[36]。

 CEET的抗炎作用在各种思考中得到了讨论,并不能抑制刺激事件,但也许它是在较早就开始并简化了炎症阶段[37]。在我们的组织学研究中,G(Aunp + CE)的聚集突出显示了第三天的直接严重反应,以及第六天的逐渐减弱至柔和。相反,对照组和接受金纳米粒子治疗的对照组在第3天的燃烧活性就很柔和,但在第6天变得极端。证明证明CEET可以及早引发火热阶段[38]。使用AuNPs的治疗支持了高强度短脉冲光束  掺钕的方式:钇,铝和石榴石的光烧蚀大大加快了康复过程,减少了微观微生物的总数,并表现出毛囊的恢复。在此,有一个例外,即准备利用圆形金纳米颗粒和CEET通过缩短火热阶段,促进血管新生和胶原生成来促进皮瓣恢复的恢复过程。就那样吧’缺乏关于在重建疗法中使用AuNP和CEET的研究,因此需要辅助疗法来开辟参与氧化抑制和刺激反应的闲置重建途径。

六,结论

在本文中,研究了圆形金纳米颗粒与CEET一起对改善皮瓣的影响。有或没有CEET的AuNPs在皮瓣恢复,皮肤损伤的能量愈合过程中的应用表明,与未治疗的类相比,这两种治疗方法对损伤的康复具有有益的影响。随后,建议同时应用金纳米颗粒和CEET来成功治愈损伤并在组织研究中获得更好的结果。需要增加体内和体外有关NP和CEET组合的定向研究,以增加有关使用中的精密仪器的信息。

致谢 

洛尔斯坦医科大学研究与技术副校长,伊朗霍拉马巴德,非常感谢,风险代码:845

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 

 
15.罗,D。, 抗菌剂的配方和外触发释放。 2017年,伦敦玛丽皇后大学。
17.丹尼尔(M.-C.)和D. Astruc, 金纳米粒子:组装,超分子化学,与量子尺寸有关的特性以及在生物学,催化和纳米技术中的应用。 化学评论,2004年。 104(1):第293-346。
26. A. Soneja,M。Drews和T. Malinski, 一氧化氮,氧化氮和氧化应激在伤口愈合中的作用。 药理学报告,2005年。 57:页。 108。