Investigation of effective parameters on electrochemical aptasensor 对于 detection of 青霉素抗生素

文件类型:原始研究文章

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1 伊斯兰阿萨德大学北德黑兰分校食品科学与技术系,伊朗德黑兰

2 伊朗德黑兰伊斯兰阿扎德大学Shahre-e-Qods分院食品科学与技术系

3 德黑兰医科大学医学先进技术学院医学纳米技术系,伊朗德黑兰

抽象

在这项研究中,通过将青霉素适体固定在电沉积到电纺碳纳米纤维(ECNF)垫上的金纳米颗粒(AuNPs)上制备的适体传感器据报道可检测牛奶中的青霉素抗生素。首先使用静电纺丝,热处理和电沉积工艺生产AuNPs / ECNF垫电极。然后,将青霉素适体(pDNA)固定在AuNPs / ECNF垫电极上。通过循环伏安法研究了金纳米颗粒的层厚,固定化的pDNA的量,pDNA和青霉素的孵育时间,实验溶液的温度和pH对电化学反应的影响。结果表明,在3mM HAuCl4浓度下可以达到合适的AuNP厚度。随着电解质中pDNA的增加,电化学电流响应也得到了增强。此外,孵育时间的增加导致CV峰值电流的提高。同时,在35的pH值为7的溶液中获得了CV的最大峰值电流°C.

关键词


介绍

青霉素作为一组β-lactam antibiotics is extensively used to prevent and cure different bacterial infections in dairy cattle. However, the excessive use of this antibiotic may cause the presence of residues in dairy product like raw milk which is a dangerous threat to human health. Therefore, it is necessary to develop a sensitive and cost effective method 对于 identification of antibiotics residues in dairy products such as milk, butter, yoghurt and cheese [1, 2].

迄今为止,已经引入了几种检测抗生素的方法,包括高效液相色谱(HPLC)[3],荧光[4],液相色谱-质谱(LC-MS)[5]和比色法[6]。 。尽管这些方法都有 由于能够精确,可靠地检测抗生素,它们通常是耗时的过程,需要复杂的样品制备,专业的用户和昂贵的仪器。因此,开发检测乳制品中青霉素残留的替代方法具有重要意义。近年来,归类为生物传感器的适体传感器因其低成本,高灵敏度,便携性和多功能性等有价值的特征而引起了青霉素检测的极大关注[7-9]。适体传感器中用作生物识别元件的适体是人工单链DNA或RNA核酸,它们可以高亲和力特异性结合其靶分子[10]。

The platform utilized 对于 the immobilization of aptamers 拥有 a significant effect on performance of biosensors. Among various platforms, gold electrode 拥有 是 widely used in aptasensor because of its unique electronic properties [11]. the low specific surface area of this electrode may be insufficient 对于 the immobilization of high amount of aptamers that results in attenuation of signal intensity. To overcome this problem, the use of nanomaterials 对于 modification of electrode 拥有 是 proposed. It was reported that aptasensor platform 拥有 是 designed with nanomaterials such as gold nanoparticles, graphene, carbon nanotubes [12]. For example, Razdari et al. constructed an electrochemical aptasensor 对于 the detection of 青霉素抗生素 using a graphite electrode modified with reduced graphene oxide and gold nanoparticles [13]. In another study, GR–Fe3O4NP和PEDOT–AuNPs composite as a platform was used to immobilize the aptamer 对于 detection of 青霉素抗生素 [14].

另一种引起人们极大关注的纳米材料是用作平台的碳纳米纤维垫,它提高了固定生物分子的表面位置,从而导致生物传感器中的信号放大[15]。用于制造碳纳米纤维毡的相对简单且廉价的方法之一是静电纺丝技术[16]。使用金纳米颗粒(AuNPs)修饰的电纺碳纳米纤维毡电极可以开发超灵敏的适体传感器,因为该电极具有独特的特性,例如良好的导电性和高电化学活性。但是,对于作者’ knowledge, no attempt has been 用于将适体装配在此电极上以检测生乳中的青霉素。因此,制造用于检测牛奶样品中青霉素的青霉素适体/ AuNPs / ECNF垫电极是一个巨大的挑战。

In this research, a novel Penicillin aptamer /AuNPs/ECNF mat aptasnsor 对于 牛奶样品中青霉素的快速检测 被设计。为此,首先将AuNPs电沉积在ECNF垫电极上。然后,将青霉素适体固定在AuNPs / ECNF垫电极上。在制造过程中,为了提高适体传感器的性能,需要使用各种参数,例如HAuCl的浓度4 优化了电解质中的适体和适体,优化了适体和青霉素的孵育时间,电解质的温度和pH。

实验性

试剂和材料

从聚丙烯公司(伊朗)获得分子量为150,000g / mol的商业聚丙烯腈(PAN)。用于溶解PAN的二甲基甲酰胺(DMF)获自Merck。氯化钾(KCl),氯化钠(NaCl),磷酸氢二钠(Na2高压氧4),磷酸二氢钾(KH2PO4),四胆金酸氢盐(HAuCl4),硫酸(H2所以 4),牛血清白蛋白(BSA),铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])和亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6])购自Sigma-Aldrich。

青霉素适体序列(5’-thiol-(CH2)6-CTG AAT TGG ATC TCT CTT CTT GAG CGA TCT CCA CA-3’)是由Faza Biotech Co.(伊朗)带来的。利用超纯水制备所有溶液。

电极制作

青霉素适体/ AuNPs / ECNF垫电极的制备包括三个步骤:制备ECNF垫,电沉积AuNPs和固定青霉素适体,具体步骤如下:

(1)根据在其他地方[16-18]中详细描述的程序进行ECNF垫电极的生产。简要地讲,纺丝溶液是通过将12%(重量)的PAN溶解在DMF中于40°使用注射泵以18 ml的针头以1 ml / h的流速将C喷射10 h。制备的PAN纳米纤维垫的稳定化在290进行°在空气中C 4小时,然后在1000碳化°在氮气氛中保持1小时。最后,使用金属打孔器将ECNF垫切成直径5 mm的圆盘。

(2) The gold nanoparticles were eletrodeposited potentiostatically at -0.4 V (versus Ag/AgCl) on the ECNF mat 对于 90 含有0.5-7 mM HAuCl的电解质溶液中溶解2秒和0.1 M H2所以 4.

(3) 青霉素适体/ AuNPs / ECNF垫电极通过滴入制备 4 µL of 1-16 µM Penicillin aptamer on the AuNPs/ECNF mat electrode surface. The modified electrode was then rinsed with 超纯 water to remove any un-immobilized aptamer. Thereafter, the residual binding sites were 被注射5阻断µ含10%BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液到电极表面并保持在 room temperature for 2 h. The electrode was washed with 超纯 water and dried at 室内温度 before further use.

Preparation of milk sample 对于 electrochemical evaluation

The milk bought from the local market was first centrifuged at 5000 rpm 对于 15 min to remove milk fat due to detrimental effect on measurements. Then, the fat free milk diluted 用20%的PBS掺加10µL 青霉素抗生素。

电化学行为研究

通过循环伏安法(CV)在含有1 mM亚铁/亚铁氰化物([Fe(CN)6]-3/-4)。测试使用μStat 400恒电位仪/恒电流仪(DropSens,西班牙)温度为15-65°C和pH值范围为5-9。在这些实验中,使用了由修饰电极作为工作电极,铂丝作为辅助电极,Ag / AgCl作为参比电极的常规三电极系统。为了研究适体传感器的性能,将青霉素适体/ AuNPs / ECNF垫电极放置在为不同孵育时间准备的溶液中。电极用 ultra pure 用水去除无限的青霉素抗生素分子。最后通过将适体传感器浸入含有([Fe(CN)6]-3/-4.

结果和讨论

以下各节介绍了不同的制造参数:

电沉积AuNPs的量

CV峰值电流响应受ECNF垫上电沉积AuNPs数量的影响。因此,研究了镀液中四氯金酸氢盐的浓度,该浓度是电沉积金纳米颗粒量的有效参数。图1显示了随着四氯金酸氢盐浓度的变化,AuNPs / ECNF垫电极和ECNF垫电极之间的峰值电流差异。可以证明随着HAuCl浓度的增加4 峰值电流的差异增加,在3 mM时达到最大值。由于ECu垫上电沉积金纳米颗粒的厚度增加而导致的3 mM峰值电流的最大差异对应于电子传递的增强,这是由HAuCl量的增加导致的 4 在电解质中。峰值电流差异超过3mM浓度的减少可以归因于金纳米颗粒涂层厚度的增加,这会破坏电极的导电性能。这一发现与Liu等人报道的结果一致。 [19]。

固定适体的量

影响AuNPs / ECNF垫电极上固定适体数量的两个关键因素是适体浓度和孵育时间。因此,研究了不同浓度的青霉素适体和温育时间以获得针对青霉素抗生素的最佳电化学反应。如图2a所示,随着适体浓度的增加,峰值电流的差异增大,直至8µM.适体浓度超过8时,未观察到峰值电流差异的显着增强µM.因此,可以得出结论,修饰电极上的活性位点在浓度为8时几乎饱和μ适体。峰值电流差异随孵育时间的变化如图2b所示。峰值电流差的增加趋势与青霉素适体的浓度相似。

青霉素抗生素的孵育时间

图3描绘了青霉素/ pDNA / AuNPs / ECNF垫电极和pDNA / AuNPs / ECNF垫电极的峰值电流与青霉素抗生素的孵育时间之间的差异。峰值电流差异增加,但在进一步的孵育时间内几乎保持恒定。也就是说,青霉素抗生素和pDNA之间的结合位点饱和发生在60分钟以上。

电解液的pH值和温度

适体传感器的性能取决于不同的参数,包括电解质的pH和温度。电解质pH值对电极峰值电流差的影响如图4(a)所示。当pH值增加到7时,电极的峰值电流差会增加。但是,随着pH值的进一步增加,电极的峰值电流差会减小。这种趋势的原因可以归因于pH值与质子化或去质子化过程之间的关系,这导致适体和青霉素抗生素之间的静电相互作用增加或减少[20]。

变化的趋势 峰值电流与温度的差异如图4(b)所示。随着温度的升高,青霉素/ pDNA / AuNPs / ECNF垫电极与pDNA / AuNPs / ECNF垫电极之间的峰值电流之差先增大,然后在35达到最大值后减小。°C. The deactivation of aptamer can be the reason 对于 decreasing the difference of peak currents [21].

结论

A novel aptasensor 对于 the detection of 青霉素抗生素 in milk sample was fabricated using immobilization of pDNA on AuNPs electrodeposited on ECNF mat electrode. The cyclic voltammetry method was used to optimize the fabrication steps of aptasensor. The results indicated that the optimum thickness of electrodeposited AuNPs 对于 maximum electrochemical response was obtained at 3 mM concentration of HAuCl4。 pDNA / AuNPs / ECNF垫电极和AuNPs / ECNF垫电极之间的峰值电流差异随适体浓度的变化表明,随着适体浓度从1增加到8µM的峰值电流之差增加,但在进一步的适体浓度中保持大致恒定。孵化时间也有类似趋势。此外,在pH为7且温度为35的溶液中获得了最佳的电化学响应°C.

 

 
1. Ju Y,Kim J,Roy M,Kim KK,Song JK,Park SM,Park M,Bahng SH,Woo N,Kang SH(2016)基于树状聚合物封装的丝网印刷碳电极的灵敏电化学青霉素传感器Pt纳米粒子,韩国化学会公告3(37):397-400。
2. Rothstein J D,Patel S,Regan M R,Haenggeli C,Huang Y H,Bergles D E,Jin L,Hoberg M D,Vidensky S,Chung D S(2005年)β-内酰胺抗生素通过增加谷氨酸转运蛋白的表达提供神经保护作用,《自然》 433(7021):73-77。
10. Adabi M(2019)使用电化学适体传感器检测铅离子,纳米医学研究杂志 4(4):247-252。
17. Niri A, Faridi-Majidi R, Saber R, Khosravani M, Adabi M (2019) Electrospun carbon nanofiber-based electrochemical biosensor 对于 the detection of hepatitis B virus, Biointerface Res. Appl. Chem 9(4022-4026.