的 nanoemulsion-based nanogel of 龙蒿 essential oil with proper activity against 热带利什曼原虫 和 大利什曼原虫

文件类型:原始研究文章

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1 法萨医科大学医学先进技术学院医学生物技术系,伊朗法萨。

2 法萨医科大学非传染病研究中心,伊朗法萨

3 法萨医科大学医学院医学院寄生虫学和真菌学系,伊朗法萨。

4 法萨医科大学医学先进技术学院医学纳米技术系,伊朗法萨。

抽象

皮肤利什曼病是最常见的利什曼病形式,分布于约100个国家。具有杀菌作用的精油基纳米制剂的制备是开发新药的有前途的策略。在这项研究中,首先研究了青蒿,百日草和生姜三种精油对热带利什曼原虫和主要利什曼原虫的前鞭毛体的杀菌作用。麦草的精油显示出最有效的活性。之后,通过向制备的粒径为7.86的纳米乳液中添加1.5%w / v的卡波姆940。±4 nm,粒径分布(SPAN)为0.96±制备0.1的ADEO纳米凝胶。纳米凝胶的杀菌作用明显优于未配制的金缕梅精油。有趣的是,前鞭毛虫的生存能力为160µg / mL浓度降低至〜0%。制备的绿色纳米制剂可作为皮肤利什曼病的辅助药物。

关键词


介绍

的 most common form of leishmaniasis is cutaneous leishmaniasis; it is distributed in around 100 countries worldwide [1]. It is caused by obligate intracellular protozoa of the genus of 利什曼原虫 [2,3]。 大利什曼原虫 and 热带利什曼原虫 在过去的世界中,农村和城市地区分别引起皮肤利什曼病[4,5]。

五价锑,miltefosine和两性霉素B是推荐用于治疗皮肤利什曼病的药物[6,7]。然而,由于它们的局限性,包括毒性和缺乏适当的功效,新药的开发已变得至关重要[8]。植物及其代谢产物是寻找具有杀螨作用的绿色物质的绝佳来源 [9]。例如,肉桂,百里香和牛至的精油(EO)对不同种类的该种前鞭毛体显示出适当的利什曼杀菌作用。 利什曼原虫 属[10,11]。 However, the effectiveness of EOs can be lost by evaporation or degradation by oxidation 和 UV light [12]. 的refore, they should be formulated.

糊剂,软膏剂和乳膏剂已广泛用于局部药物递送。这些配方非常粘。因此,它们的使用具有挑战性。 [13,14]。纳米乳剂用于局部药物递送的使用近来已引起更多关注。它们具有许多优势,例如更高的皮肤渗透性和保留力以及较长的保存时间[15,16]。基于纳米乳剂的纳米凝胶是用于局部药物递送的另一剂型,其具有纳米乳剂的优点以及改进的稳定性和便利的使用。它们广泛用于化妆品和药物制剂中[17,18]。

在这项研究中,三种具有医学意义的EO的杀菌作用包括 龙蒿 (ADEO), 百日草一个(ZMEO), and  (ZOEO)针对 L.专业 and 热带乳杆菌 were investigated. 的n, by preparing nanoemulsion-based nanogel of ADEO (more active than others), we tried to improve the effectiveness.

材料和方法

用料

ADEO和ZMEO获自Zardband Pharmaceuticals Co(伊朗)。 ZOEO由Green Plant of Life Co.(伊朗)提供。 L.专业(MHOM / IR / 75 / ER L. tropica (MHOM / SU / 74 / K27由伊朗巴斯德研究所提供。吐温20(聚山梨酯20),NaOH(氢氧化钠)和MTT粉末(3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基溴化四唑)购自Merck Chemicals(德国)。青霉素-链霉素,RPMI细胞培养基,DMSO(二甲基亚砜) 从Shellmax Co.(China)购买。 FBS(胎牛血清)和Carbomer 940分别从Gibco公司(美国)和SDFCL公司(印度)购买。

香精油的杀菌作用研究

在48孔板中使用MTT测定法研究了EO的杀菌作用。通过将储备溶液进行两次连续稀释来制备每种EO所需的稀释系列。储备溶液5120µ使用含水PBS(含0.5%DMSO)制备微克/毫升。的前鞭毛体  L.专业 and 热带乳杆菌 (625000/mL) at the logarithmic phase were used for the leishmanicidal bioassays. 的y cultured in RPMI complete medium (FBS 10% 和 Penicillin-Streptomycin 1%).

首先400µ每个前鞭毛体的升/孔和连续稀释(400µL /孔)加入48孔板中,于25孵育24小时ºC. After that, 50 µ加入L /孔的MTT溶液,再孵育4小时。之后200µ向每个孔中加入1升DMSO以溶解甲maz晶体。最后,使用酶标仪(Synergy HTX Multi-Mode Reader,USA)在570 nm处读取孔的光密度(A),并使用公式1计算活力。

在这三个重复的每一个中,均考虑了对照组和空白组(n = 3)。对照组的孔充满,类似于样品组。只有400µ使用L的PBS代替EO系列稀释。同样,空白孔中装有相同量的RPMI完全培养基和PBS(400:400µL).

 (1)

GC-MS分析

仅确定了ADEO的成分,因为它显示出比其他检查的EO更好的活性。对于化学成分,如我们先前的研究所述使用了GC-MS分析[19]。

的 procedure of preparation of nanoemulsion

对于纳米乳液的制备,ADEO(50µL)和补间20(100-1000µL)以500 rpm混合10分钟以制备均匀的混合物。然后将蒸馏水滴加到油相中达到5000µL.将混合物在2000rpm下再搅拌30分钟以形成纳米乳液。粒径最小且可接受的纳米乳液 粒度分布(SPAN),即<最终选择1,作为最佳纳米乳液。

的 使用以下方法研究了制备样品的粒径SPAN 动态光散射(DLS,K-ONE.LTD,韩国)在25 ℃。 SPAN使用公式计算  ,其中D是粒子的直径。 D10,D50和D90是直径小于这些值的粒子的百分位数。

的 procedure of preparation of nanogel

选择最佳的纳米乳液用于制备基于纳米乳液的纳米凝胶。首先,在温和的磁力搅拌(120 rpm,过夜)下,将作为胶凝剂的卡波姆940(1.5%w / v)分散到纳米乳液中。然后通过添加NaOH溶液(25%w / v)将pH从4升高至〜7,以完成胶凝过程。还用相同的方法和成分制备了空白凝胶,只是没有ADEO。

的 stability of the prepared nanogel was 6-month monitored at two temperatures (4°C和环境温度)。另外,使用流变仪在25℃下研究了纳米凝胶的粘度。°C(Anton Paar流变仪,型号MCR-302,奥地利)。

评估纳米凝胶的杀菌作用

纳米凝胶和空白凝胶’如下使用MTT测定法研究了其杀螨活性。 400μ每个前鞭毛体的升/孔数和400μ首先很好地添加L /孔的PBS。之后,是6.4(± 5% w) 和 12.8 (±将5%(重量)mg的样品(纳米凝胶和空白凝胶)加入孔中。如第2.2节所述继续进行该过程。通过添加上述数量的纳米凝胶,ADEO的浓度最终固定为80和160μg/mL.

统计分析

用于确定每种EO对前鞭毛体的半数最大抑制浓度(IC50) 热带乳杆菌 and L.专业, 使用了CalcuSyn软件(英国BIOSOFT的免费版)。使用单向方差分析将EO的IC50进行比较。另外,使用独立的样本t检验比较了ADEO和纳米凝胶的杀菌作用。使用SPSS软件(v。21,IBM,美国)以95%的置信区间进行分析。

结果

环氧乙烷的杀菌作用

的 leishmanicidal effects of the EOs are given in Fig. 1. Effectiveness of ADEO with IC50 of 111 和 114 µg/mL against 热带乳杆菌 and L大分别明显优于ZOEO和ZMEO(单向方差分析,信号< 0.05). 的 obtained IC50s for 热带乳杆菌 and L.专业 ADEO治疗后无显着差异(独立样本t检验,信号>0.05)。此外,浓度为80µg/mL, their viability was reduced to 50%. 的refore, this point was selected to investigate the effect of nanoformulating ADEO into a nanogel dosage form.

ADEO的成分

的 five major constituents of ADEO included p-allyanisole, cis-ocimene, beta-cimene Y, limonene, 和 3-methoxycinnam aldehyde with portions of 67.623, 8.691, 7.577, 4.338, 和 1.490%, respectively.

制备的纳米乳液基纳米凝胶

制备了十种配方以获得具有小粒径和窄粒径分布(SPAN)的合适纳米乳液<1)。其成分和成分列于表1。仅F8(0.96± 0.01) 和 F9 (0.95 ±0.01)在制备的样品中具有可接受的SPAN。但是,F8(7.86±4 nm)明显低于F9(245±13 nm);因此,它被选为最佳纳米乳液。

通过将1.5%w / v的卡波姆添加到最佳纳米乳液中来制备ADEO纳米凝胶。最佳纳米乳液和纳米凝胶的图描述在图2A中。此外,图2B显示了最佳纳米乳液的DLS分析。

纳米凝胶的粘度遵循非牛顿流体,其粘度随着剪切速率的增加而降低。有趣的是,在不同剪切速率下的粘度变化遵循Carreau-Yasuda模型(见图2C)。此外,在4℃下保存6个月后,在纳米凝胶中未观察到相分离,沉淀和乳化。°C和环境温度,确认其适当的稳定性。

的 leishmanicidal properties of the nanogel

从 图3,空白凝胶降低了 热带乳杆菌 and L.专业 to 87 ± 4% 和 93 ±分别为3%。然而,ADEO的杀菌作用(80µg / mL)显着优于空白凝胶,对两种前鞭毛体的存活力约为50%(独立样本t检验,信号<0.05)。具有ADEO 80的纳米凝胶的杀菌作用µg / mL,明显优于未配制的ADEO(独立样品t检验,信号< 0.05); viability of 热带乳杆菌 and L.专业 were reduced to 23 ± 4% 和 21 ±分别为3%。有趣的是,以更高的浓度使用纳米凝胶(具有ADEO 160µg / mL),观察到效率为100%;前鞭毛体的活力降低到0%(未提供数据)。

讨论

从文献中可以看出,一些EOs的杀菌活性(IC50) 热带乳杆菌 已经报道例如 百日草 (89.30 µg/mL), 百里香 (35.00µg/mL) 和 尼吉拉 sativa (9.30µg / mL)[20-22]。此外, 柑橘柠檬柠檬角柏, 和 薰衣草 对...具有杀菌作用 L.专业 IC50为231.40、38.00和110.00µg / mL [23-25]。考虑到结果,ADEO显示出对上述前鞭毛体的可接受的效率。

在已开发的用于局部药物递送的纳米制剂(纳米乳剂,脂质体,脂质体和聚合物纳米颗粒)中,纳米乳剂的制备比其他方法更简单,不需要先进的设备[16,26]。然而,低粘度的纳米乳剂不适用于局部应用。使用增稠剂或胶凝剂以增加其粘度。通过添加一种胶凝剂,例如黄原胶,乙基纤维素,羧甲基纤维素钠,羟丙基甲基纤维素和卡波姆,将纳米乳液转变为纳米凝胶[27,28]。

已经发现有关制备基于纳米乳液的EO或化学药物纳米凝胶的报道。例如槲皮素’s纳米凝胶(抗风湿 drug) 通过将carbopol 940(1.0%w / v)添加到具有130nm的粒径的初级纳米乳剂中来制备。毒品’通过增加皮肤通透性并增强其理化稳定性来改善治疗效果[29]。此外,通过制定 迷迭香 EO成纳米乳液,IC50对 L.专业 从260降低至80μg / mL [30]。简而言之,通过制备基于纳米乳液的纳米凝胶,至少可以实现三个优点。改善杀菌效果,控制EO挥发性并促进局部使用。

结论

研究了三种具有重要医学意义的EO的杀Leishman杀虫特性。然后制备最有效的EO,ADEO的基于纳米乳液的纳米凝胶。治疗后的前鞭毛 热带乳杆菌 and L.专业 纳米凝胶(160µg / mL),其活力降低至〜0%。

致谢

的 authors appreciated Fasa University of Medical Sciences for support of this research, grant No, 97098. Besides, this study was ethically approved (IR.FUMS.REC.1397.094).

利益冲突

没有作者宣布有利益冲突。

 

 
1. Golpayegani AA,Moslem AR,Akhavan AA,Zeydabadi A,Mahvi AH,Allah-Abadi A.影响伊朗疫源性人畜共患的人畜共患性皮肤病和人畜共患内脏利什曼病流行的环境因素建模:基于遥感和GIS的研究研究。节肢动物传播疾病, 2018;12 (1):41-66.
3. FEKRI SM,Dabiri S,FOTOUHI AR,FANI ML,AMIRPOOR RS,Ziasistani M,DabiriD。实时PCR的设计和验证:伊朗常见利什曼原虫物种的定量诊断。伊朗医学档案, 2016;19 (7):496-501.
12. Bergkvist TP。四种挥发性精油的抗菌活性:Citeseer; 2007年。
13. Bhowmik D, Gopinath H, Kumar BP, Duraivel S, Kumar KS. Recent advances in novel topical drug delivery system. 的 Pharma Innovation, 2012; 1(9,A部分):12。
17. Modi JD,Patel JK。用于局部递送的醋氯芬酸的基于纳米乳剂的凝胶制剂。国际药学与药学研究杂志, 2011;1 (1):6-12.
19.Osanloo M,Sedaghat MM,Sereshti H,Rahmani M,Saeedi Landi F,AmaniA。龙蒿精油的壳聚糖纳米胶囊,具有低细胞毒性和作为绿色纳米杀幼虫剂的持久活性。纳米结构学报, 2019;9 (4):723-735.
23. Sanchez-Suarez J,Riveros I,DelgadoG。对源自十种哥伦比亚植物的香精油的杀菌和细胞毒性潜力的评估。伊朗寄生虫学杂志, 2013;8 (1):129-136.
25. Shokri A,Saeedi M,Fakhar M,Morteza-Semnani K,Keighobadi M,Hosseini Teshnizi S,Kelidari HR,Sadjadi S.薰衣草和Rosmarinus Officinalis精油和纳米乳剂在利什曼原虫上的抗脂活性/ 75 / ER)。伊朗寄生虫学杂志, 2017;12 (4):622-631.
27. Bhanu PV,Shanmugam V,LakshmiP。用于局部药物递送的新型双氯芬酸乳胶的开发和优化。 Int J Comp Pharm, 2011;2:1-4.
30. Shokri A,Saeedi M,Fakhar M,Morteza-Semnani K,Keighobadi M,Teshnizi SH,Kelidari HR,Sadjadi S.薰衣草和Rosmarinus officinalis精油和纳米乳剂在利什曼原虫上的抗菌活性(MRHO / IR / 75 / ER)。伊朗寄生虫学杂志, 2017;12 (4):622.