CS / PEO /头孢唑啉纳米纤维的制备及表征

文件类型:原始研究文章

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伊朗德黑兰Malek Ashtar工业大学生物化学与生物物理学系,科学与生物技术教育研究中心

抽象

目标: 研究了壳聚糖/聚环氧乙烷(CS / PEO)纳米纤维的静电纺丝以及头孢唑林的添加,以产生具有抗菌特性的纳米纤维。
方法: 通过静电纺丝法制备了包括CS / PEO和CS / PEO / cefazolin的聚合物纳米纤维。纳米纤维的直径范围是60-100 nm,并使用ImageJ软件进行测量。使用扫描电子显微镜(SEM)研究了电纺纳米纤维的形态。此外,通过FT-IR评估了纳米纤维的化学结构。还通过紫外可见分光光度法研究了纳米纤维的药物释放。通过包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在内的两种类型的细菌来测试支架的抗菌活性。在大鼠上研究了纳米纤维的愈合能力’s wound.
结果: SEM图像表明头孢唑啉的添加量高达1wt%带来了最佳的纳米纤维。而且,电纺纳米纤维的形态取决于溶液的粘度和CS / PEO /头孢唑啉的比率。根据头孢唑啉从纳米纤维释放的结果,在CS / PEO / 1wt%头孢唑啉纳米纤维作为愈合样品的存在下获得了最佳结果。在动物研究中,研究了纳米纤维在大鼠烧伤创面愈合中的作用,并通过包含1%wt头孢唑啉的纳米纤维观察了伤口的改善。
结论: 根据这些结果,似乎CS / PEO / 1wt%的头孢唑啉纳米纤维是伤口覆盖剂的好选择,并且在其结构中保持更多的水分,因此伤口表面在愈合过程中保持湿润,从而防止纳米纤维粘附到皮肤上。伤口表面。

图形概要

CS / PEO /头孢唑啉纳米纤维的制备及表征

关键词


介绍

迄今为止,已经使用了具有不同特征的各种方法来覆盖伤口类型。对于具有伤口涂层,应考虑一些特征,例如:生物相容性,生物降解性,伤口愈合促进剂和防止疤痕形成。近来,一些纳米颗粒例如银作为抗微生物剂受到相当大的关注。但是,在将纳米颗粒作为抗菌剂应用之前,需要对纳米颗粒对健康和环境的影响进行全面评估。纳米粒子的尺寸很小,这些纳米粒子很容易进入皮肤,肺部和大脑,并造成不良影响。传统方法存在缺陷,通常没有上述特征。为了实现这一目标,在本研究中,我们通过电纺丝设备制备了具有头孢唑啉添加剂的壳聚糖和PEO聚合物的纳米纤维。壳聚糖是一种具有生物相容性的天然聚合物,具有不同的特性,例如:生物降解性,生物相容性[1,2],缺乏毒性,可凝结性,抗原性,缺乏水溶性和胶凝特性,抗菌,抗真菌和抗病毒效果,在伤口敷料和损伤[3,4],伤口愈合[5],药物输送系统[6]和组织工程中的各种应用[7,8]中具有广泛的应用。壳聚糖在骨组织工程中的应用[9,10],体外[11]和活组织[12]进行了综述,并在骨形成中显示了壳聚糖的增强作用。

然而,单独的壳聚糖不可能静电纺丝,因为它在水中的溶解性差,在水溶液中的粘度高,并且可以在其他聚合物存在下进行。 PEO已成为非常有用的合成聚合物,因为它具有不同的分子量,并且在大多数溶剂(尤其是水)中具有基本的溶解性[13,14]。生物相容性[15],低毒性[16],  以及在水溶液中生产纤维的能力[17-18]。将该聚合物与天然聚合物(如壳聚糖)一起使用可形成具有高机械性能的均匀纤维,而不会降低壳聚糖的伤口愈合潜力[2,19]。另一方面,发现使用50%乙酸水溶液作为溶剂,可以由2wt%的壳聚糖和4wt%的PEO(壳聚糖/ PEO的比例为90%)制备具有高壳聚糖含量的壳聚糖基纳米纤维。 / 10)无其他添加剂的溶液。还发现壳聚糖/ PEO比为90/10的基质在水中保留了优异的纤维结构完整性[20]。在这项研究中,头孢唑林抗生素被用于增强纳米纤维的抗菌性能。头孢唑林(头孢菌素的第一代)是一种糖肽抗生素,可抑制细菌细胞壁的形成并引起细胞溶解。每个细菌都需要转肽酶和羧肽酶来连接前体并构建其细胞壁。头孢菌素抗生素阻止转肽酶活性。每一代新的头孢菌素都具有比前一代显着更大的革兰氏阴性抗菌特性,在大多数情况下,它们对革兰氏阳性生物的活性降低。然而,第四代头孢菌素具有真正的广谱活性。对头孢菌素类抗生素的抗药性可能涉及降低现有青霉素结合蛋白(PBP)组分的亲和力或获得补充β-内酰胺不敏感的PBP。头孢唑林的分子量为450-500 kDa,是水溶性的,相对于pH和温度的变化相对稳定,可用于皮肤感染和软组织[21]。作为第一代头孢菌素抗生素,头孢唑林和其他第一代抗生素对革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌非常有效。头孢唑啉可用于多种感染,例如:皮肤和皮肤结构感染(由于金黄色葡萄球菌对青霉素敏感和耐青霉素,A组β-溶血性链球菌和其他链球菌菌株);骨骼和关节感染(由于金黄色葡萄球菌);尿路感染(归因于大肠杆菌,奇异毕赤酵母和克雷伯菌)。

 在其他研究中,CS-PEO-1%硅土-0.5%头孢唑啉垫被认为是生物医学和伤口敷料的药物输送系统[22]。

因此,在这项研究中,通过电纺丝方法制备了聚合物/头孢唑啉复合垫,以有效地控制头孢唑啉药物的递送。

壳聚糖的抗菌性能与抗菌药物相结合的抗菌性能相结合,是制备适合伤口敷料应用的纳米纤维材料的有前途的策略。在这项研究中,一步法–在普通溶剂中静电纺丝–已用于制备基于壳聚糖,PEO和头孢唑啉抗生素药物的纳米纤维。由于纯壳聚糖的旋转能力具有挑战性,因此壳聚糖/ PEO共混物被用作基质相,头孢唑啉作为增强相,以改善壳聚糖纳米纤维的伤口愈合性能。

具有1%wt头孢唑啉的纳米纤维具有合适的抗菌性能。这项研究的新工作是添加1%wt的头孢唑啉抗生素以增加抗菌活性,体内试验显示出纳米纤维的良好性能。我们可以将这种纳米纤维用作皮肤烧伤和其他医学用途的新型纱布。

材料和方法

乙酸,吐温80和营养琼脂的培养环境是从默克公司制备的。头孢唑林钠盐购自德黑兰药物。大肠杆菌(E.coli)(ETEC ATCC 35401),金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC 6538),壳聚糖和PEO的中等分子量,分子量为900000 g.mol -1 购自Sigma-Aldrich。静电纺丝(ES100型,伊朗Fanavaran纳米-Meghyas公司),扫描电子显微镜(MV2300型,捷克Camcam SEM公司),FT-IR(Spectrum GX型,美国Perkin Elmer Co.) -Vis分光光度计(日本日立公司的U-3010型),培养箱(JTSL 40型, 使用了伊朗的Jal Tajhiz公司。

 

溶液和纳米纤维的制备

含或不含抗生素的壳聚糖/ PEO溶液(90至10)的制备

壳聚糖/ PEO混合物的制备方法是:将0.27 g中等分子量的壳聚糖粉末缓慢加入适量的50%乙酸中的0.04 g PEO中。然后,向该溶液中加入0.25mL的吐温80作为乳化剂。使用电磁搅拌器在室温下以200 rpm搅拌制备的溶液12小时,得到均匀的溶液。

为了制备壳聚糖/ PEO /头孢唑啉溶液,将百分数为0.5、1、2和3wt%的头孢唑啉添加到壳聚糖/ PEO的聚合物溶液中并混合。首先将抗生素试剂溶解在相同的溶剂中,然后在搅拌的同时将其缓慢添加到聚合物溶液中,以产生均匀的溶液,然后再进行静电纺丝。通过调节静电纺丝溶液中药物的1wt%浓度,该方法可以容纳大量要加载到纳米纤维中的抗生素。

 

由聚合物溶液制备纳米纤维

在该阶段中,为了生产电纺纳米纤维,将制备的溶液供应到带有不锈钢毛细管针(内径= 0.9 mm)的5 mL注射器中。在室温下进行静电纺丝,并在17-20 kV电压下以0.3-0.5 mL / h的进料速率从注射泵中注入溶液。将电纺纳米纤维组装在收集器上,该收集器放置在距针尖10 cm处并以400 rpm旋转。为了获得具有适当厚度的纳米纤维,进行了10小时的静电纺丝。为了从纳米纤维中完全蒸发掉溶剂和水,将它们在室温下干燥。

 

纳米纤维的生物降解和溶胀

pH 5.5和37的缓冲液o为了检查制备的纳米纤维的降解和溶胀,将温度作为人类皮肤的模拟。

通过将壳聚糖/ PEO /头孢唑啉纳米纤维垫的片段浸入500 mL缓冲液中于37℃,研究了纳米纤维支架的降解和吸水能力。oC持续24小时。然后,将湿的纳米纤维置于两个过滤器之间,以除去过量的缓冲溶液。

通过扫描电子显微镜研究了纳米纤维结构的形态以及它们的降解和溶胀。

 

表面形态分析和纳米纤维直径的测量

  为了分析样品的表面形态和纳米纤维直径,使用扫描电子显微镜。为此目的,已经将纳米纤维收集在收集器上的铝箔上并进行了切割。离子涂层机E5200模型在准备好的样品上施加1kV电压,并用金覆盖5分钟。另外,使用“ Image J”软件确定平均纳米纤维直径。

 

紫外-可见光谱仪从纳米纤维释放药物的模板

通过紫外可见光谱仪研究了纳米纤维支架中头孢唑啉的释放模板。 5×将5厘米的壳聚糖/ PEO /头孢唑啉纳米纤维段置于37毫升5毫升缓冲液中o为了研究药物向缓冲液中的释放。在特定时间从该溶液中取样,并从200-800 nm波长记录释放的活性物质的UV-Vis光谱。最大波长(λ 最高头孢唑啉的)为273nm。

 

制备的纳米纤维的FT-IR分析

    FT-IR是研究聚合物的常用光谱方法之一。我们使用该技术调查了纳米纤维制备过程中的化学变化并确认了化学附着。聚合物纳米纤维的FT-IR光谱是通过将样品放在两个0.25 mm厚度的KBr窗口间隔物之间​​来测量的。为此,记录了壳聚糖/ PEO和壳聚糖/ PEO /头孢唑啉纳米纤维的FT-IR光谱。

 

纳米纤维的体外和体内测试

为了研究纳米纤维的体外抗菌性能,我们使用琼脂平板法对其进行了测试。通过半定量方法评估了电纺CS / PEO和CS / PEO / 头孢唑林纳米纤维对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌ATCC 6538和革兰氏阴性大肠杆菌ATCC 35401的抗菌活性,这些细菌通常在烧伤伤口上发现。基于在细菌培养基Mueller-Hinton琼脂上的扩散,即众所周知的抗菌素,制备并用于抗菌测试。在大多数测试方法中,建议使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌。这两个物种具有潜在的致病性,因此在处理时需要适当的物理遏制设施。许多研究已将它们用作测试微生物,可以在标准实验室中对其进行培养和处理,以将健康风险降至最低。

首先通过75%乙醇处理对纳米纤维进行灭菌。然后,将这些纳米纤维垫捕获到5毫米的圆盘中,并放在Mueller-Hinton琼脂平板上的培养物中。将板在37℃温育oC在24小时,并测量细菌的抑制区以确定最小抑制浓度(MIC)。

此外,通过成年大鼠的烧伤伤口模型评价伤口的愈合活性。健康雄性大鼠重150–选择200g用于研究。将动物分为4组,每组2只动物。

伤口愈合活性按照表2中所示的规程进行。该动物因氯仿和1.5昏迷。×用直径1.5厘米的沸水管将大鼠背面的1.5厘米段燃烧几分钟,并用70%的酒精对皮肤伤口进行消毒。

之后,在对照组中用无菌纱布将伤口吸干,在治疗组(III,IV组)中,动物伤口上的各个纳米纤维在受伤后的第3、5、7、10天进行研究,并且伤口大小测量(三个重复测试)。

 

 结果与讨论

壳聚糖/ PEO的静电纺丝比例为90:10

收集在铝箔上的样品的SEM图像显示,所有纳米纤维都经过定期电纺而没有珠子(图1)。

 

壳聚糖/ PEO /头孢唑啉溶液的静电纺丝

SEM图像显示了含有不同浓度头孢唑林的壳聚糖/ PEO电纺纳米纤维的形貌(图2)。在头孢唑啉浓度为0.5和1 wt%的情况下,均一的纳米纤维在集电体的表面形成。加入2%和3wt%的药物会在纳米纤维之间形成大量的珠子,因为在溶液中没有完全溶解的抗生素,并且抗生素在分布有2%和3wt%抗生素的垫子上的分布无法产生均匀的溶液。这些纳米纤维的SEM图像显示出白色珠粒和纳米纤维直径,并且纳米纤维结构中的珠粒数目增加了3wt%和更多的药物。我们选择了1wt%的抗生素用于下一步测试。

由于溶液粘度,表面张力和电导率的变化,在聚合物溶液中包含抗生素可能会对聚合物的电纺丝性和纳米纤维的形态产生某些影响。纳米纤维直径的确定是通过“Image J”软件,而无需添加更高量的抗生素。通过使用该软件,可以确定至少50根纳米纤维的直径,并计算出平均直径。包含1wt%的药物的纳米纤维的平均直径为92.5nm。该直径是纳米纤维的合适直径,并且比CS / PEO / 1wt%抗生素纳米纤维的电纺丝的其他研究要低,这是一个很好的结果[22]。具有0.5重量%的头孢唑啉的纳米纤维的形态是合适的并且没有珠子,但是在2重量%和3重量%的头孢唑啉中,纳米纤维不能显得非常合适。低直径 纳米纤维具有良好的优点,例如更大的表面积/体积比,纳米纤维与细胞的更好的相互作用,对伤口的湿度的更多控制以及将药物装载在孔中并最终增加抗菌性能的能力。

 

抗生素释放

为了研究含有抗生素的纳米纤维的释放,将纳米纤维浸入pH 5.5和37的磷酸盐缓冲液中°C.在一段时间内,测量药物的释放。首先,有必要绘制校准曲线,然后,以头孢唑啉浓度在0和2 mg / mL之间的吸光度为参数来确定头孢唑啉的校准曲线,并将校准曲线拟合到Lambert–啤酒法。获得了头孢唑啉浓度(y)与吸光度(x)之间的线性关系(y = 0.925x-0.187和R2= 0.855)。将所有实验重复3次或更多次,并将实验数据表示为平均值±标准误差偏差。图3显示了吸收与抗生素浓度之间的关系。

为了评估纳米纤维负载的药物量,使用了紫外-可见光谱仪进行分析。

图4显示了头孢唑林随时间的释放曲线。头孢唑林 ’释放迅速,在两天内适度交付。在早期,从含有1wt%抗生素的纳米纤维释放的大多数药物约为26%,并在接下来的时间增加。此版本持续到大约两天。药物和壳聚糖之间的联系可能是氢键,纳米纤维的最大释放量约为65%,然后在下一次保持恒定。

该释放模板可归因于制备的纳米纤维的多孔结构,其导致缓冲剂渗透到纳米纤维的孔中,因此释放过程缓慢发生。在某些日子中,活性物质的适度输送会导致伤口更好地愈合和治愈。

发现该试剂在水性环境中的释放遵循两相曲线:最初的突释释放,随后是缓慢得多的过程。高突发释放可归因于两个原因。首先,纳米纤维中非常小的直径和高的表面积提供了短的扩散路径,并有利于药物的质量转移。第二,在静电纺丝过程中,大多数阳离子药物由于其离子强度而很可能位于纳米纤维的表面。在这种空间布置中,药物可以容易地溶解并释放到溶液中。

 

FT-IR光谱 纳米纤维

静电纺丝纳米纤维的FT-IR光谱范围为400至4000cm-1 图5显示了室温下的温度。图5a显示了3600-3200cm之间的带−1 赋予了壳聚糖的O-H和N-H键以及PEO的O-H键的拉伸模式。 NH的N-H弯曲振动2 组出现在约1569厘米-1。此外,乐队位于2960-2874厘米之间-1归因于C-H键和1243厘米带的对称拉伸模式-1 被安排了to 日e symmetrical bending vibration of 日e methylene groups. The band at 1736 cm−1 对应于壳聚糖羰基的C = O拉伸振动。此外,乐队1342厘米-1 被安排了–C–O伸展壳聚糖中的主要醇基。如图5b所示,大约3359厘米处的宽带−1 分配给壳聚糖和头孢唑啉的O-H和N-H键以及PEO骨架中的O-H键的拉伸模式。此外,乐队位于1630厘米-1 归因于头孢唑啉中羧基的拉伸方式。

另外,如图5b和6所示,头孢唑啉的噻二唑部分的吸收带为C = N(1399cm−1), C–S (561 cm−1)和涉及NCS部分(1034cm−1)。另一个带在920厘米处−1 可能与C-C组的拉伸振动有关。乐队在839厘米−1 对应于四唑环的N-H拉伸和弯曲振动。

 

纳米纤维的生物降解和溶胀

           纳米纤维的降解顺序是将其结构损失成没有特定形式的聚合物。图7示出了将不同浓度的头孢唑啉纳米纤维浸入缓冲液后的CS / PEO的SEM图像。壳聚糖或PEO均不能在缓冲液中降解24小时。壳聚糖/ PEO / 3 wt%头孢唑林的电纺纳米纤维已在缓冲液中完全溶解。该结果可能是由于头孢唑林插入纳米纤维中。头孢唑林是水溶性的,可能会增加纳米纤维在缓冲液和水中的溶解度。因此,通过增加头孢唑啉的百分比,可以看到更多的结构干扰。

而且,CS和PEO都是亲水性聚合物。与水相互作用的大趋势可能是由于CS,PEO和头孢唑啉官能团与水分子之间的氢键相互作用增加。

值得注意的是,由于CS和PEO都是可溶于酸性水性环境的亲水性聚合物,为了将CS-PEO纳米纤维垫应用于生物医学应用,必须制备具有所需润湿性的合适垫。

最后,溶胀和降解试验表明,大部分降解和溶胀与含有3wt%头孢唑啉纳米纤维的CS / PEO有关,而降解和溶胀与含有0.5wt%头孢唑啉纳米纤维的CS / PEO有关最少。 

使用以下公式计算样品的吸水率或溶胀率,其中W0 是干燥样品的初始重量,Ws是平衡时样品的膨胀重量。

膨胀百分比=(Ws−W0)/瓦0100

溶胀百分率的曲线如图8所示。

 

纳米纤维的体外和体内测试s

在微生物试验中,围绕纳米纤维形成的区域直径被认为是抗菌活性的指标。定量方法用于确定抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。这些MIC提供了细菌对抗菌化合物的敏感性估计。需要测量区域直径的定量方法提供了细菌对抗菌化合物敏感性的可重复性估计。一种这样的标准化程序需要使用标准化的接种物浓度。 该程序使用浸渍有30毫克头孢唑啉的纸质圆盘来测试微生物对头孢唑林的敏感性。

区域的大小指示纳米纤维中的抗菌活性水平,并受抗菌剂效力,浸入琼脂的量和释放速率的影响。但是,如果样品中的抗菌剂无法扩散到琼脂中,例如固有的抗菌壳聚糖纳米膜或持久地附着有抗菌剂的纺织品,则不应预期会有抑制区域。该抑制区域已用于检查负载抗生素的静电纺丝纳米纤维的抗菌活性。

壳聚糖/ PEO / 1wt%头孢唑啉纳米纤维的抗菌研究(图9)表明,该支架具有抗菌作用,并且在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均存在的情况下产生了抑制区。这意味着头孢唑啉破坏了两种类型的细菌膜,但是头孢唑啉对革兰氏阳性细菌生长的抑制作用大于革兰氏阴性细菌。