壳聚糖纳米颗粒与干酪乳杆菌提取的抗氧化-抗菌成分联合使用的耐久性研究及复合纳米粒子中抗菌成分的可能增加

文件类型:原始研究文章

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1 伊朗德黑兰Alzahra大学生物科学学院微生物学系

2 阿米尔卡比尔工业大学聚合物工程与色彩技术系,伊朗德黑兰

抽象

目标: 这项研究考虑了壳聚糖纳米粒子与从中提取的抗氧化剂-抗菌成分的组合 干酪乳杆菌 并研究了杂化纳米粒子中级分的抗菌活性可能增加以及该级分对壳聚糖纳米粒子稳定性的影响。
方法: 从中提取抗氧化抗菌材料 干酪乳杆菌 通过薄层色谱分离法完成上清液。为了测定级分的抗氧化剂和抗菌活性,分别使用了DPPH(2,2-二苯基-1-吡啶并肼基)测定法和通过微孔稀释法测定的最小抑菌浓度(MIC)。对于壳聚糖纳米颗粒(Cs NPs)的形成,使用了离子凝胶法,并优化了三聚磷酸五钠(TPP):壳聚糖的比例。对于负载有抗氧化剂馏分的壳聚糖纳米颗粒,将馏分物理掺入壳聚糖纳米颗粒中。通过扫描电子显微镜(SEM)监测颗粒形态。
结果: Rf = 0.03的一个极性组分具有很强的抗菌活性,显示了萜类化合物的特征。与单独的Cs-NPs相比,负载壳聚糖纳米颗粒的抗氧化剂和抗菌材料的寿命更长。抗氧化剂-抗菌材料从CS NPs释放得相对缓慢。与Cs NPs结合后,该级分的抗菌特性提高了约8-16倍。
结论: Cs NPs与从中分离的抗氧化剂-抗菌成分的组合 干酪乳杆菌 增加Cs NPs的稳定性和级分的抗菌活性也大大提高。 

图形概要

壳聚糖纳米颗粒与干酪乳杆菌提取的抗氧化-抗菌成分联合使用的耐久性研究及复合纳米粒子中抗菌成分的可能增加

关键词


介绍

如今,纳米技术已在制药行业中找到了广泛的应用[1]。由于纳米技术的新推广,现在可以实现可以以不同方式使用的药物纳米颗粒[2]。在过去的几年中,壳聚糖的微米级和纳米级颗粒被认为是生物医学和制药领域中的一种有吸引力的化合物[3-5包括伤口敷料4],延长或控释药物输送系统[3],血液抗凝剂[6]和空间填充植入物[7]。

壳聚糖是由N-乙酰基氨基葡萄糖和氨基葡萄糖单元构成的共聚物构建物[8]。它具有抗菌和抗真菌特性[9-11]。此外,壳聚糖最近已被用作抗菌药物的辅助剂,以提高其药理活性[12]。尽管这种聚合物具有巨大的潜力,但随着时间的推移其稳定性较差,使得基于壳聚糖的体系不适合用作最终药品[13]。在储存时,壳聚糖经历逐渐的链降解,随后消除其官能团,结果导致不可逆地缺乏其理化性质。内在因素(分子量,脱乙酰基程度,纯度和水分含量)和外在因素(热加工,环境储存条件,灭菌和涉及酸性溶解的加工)均被认为是影响基于壳聚糖的制剂稳定性的关键参数。为了提高壳聚糖的稳定性,还报道了几种策略(在制备过程中添加稳定剂,使用离子或化学交联剂以及与亲水性聚合物共混)[14]。结果,科学家们尝试改善壳聚糖产品的稳定性[13]。

Jang和Lee(2008)表明,通过向壳聚糖纳米颗粒中添加抗氧化剂如L-抗坏血酸,可以增强NP的稳定性[15]。在这项研究中,稳定剂(如抗氧化剂)的添加用于提高制备过程中壳聚糖纳米颗粒的稳定性。为此,从 乳杆菌 spp。已经提出。 乳杆菌 spp。是健康的人类微生物群的重要成员,被证明具有抗氧化特性[16]。我们报告了从中提取的具有抗菌活性的抗氧化剂成分 干酪乳杆菌 先前的研究中的菌株K1C(登录号KU954559)(未公开数据)。这项研究的目的是比较单独和与壳聚糖纳米颗粒混合后抗氧化剂组分的抗菌活性,并评估有无分离组分的壳聚糖的寿命。

 

材料和方法

穆勒–欣顿汤(MHB)(德国默克),壳聚糖(DD>75%,MW = 120kDa,德国默克),三聚磷酸五钠(TPP)(德国默克), 乙酸(德国默克)  sodium 氢氧化物(Merck,德国),磷酸盐缓冲盐水(PBS,Sigma Aldrich),硅胶60 F254板(Merck,Darmstadt,德国),甲醇(Merck,德国),氯仿(Merck,德国),DPPH(Sigma,美国) )。牛乳气是在伊朗德黑兰省收集的。根据Wegkamp等人的方法制备PMM5肉汤。 (2009)[17]。所有其他材料均购自美国Sigma。

 

从中提取抗氧化抗菌材料 干酪乳杆菌 上清液

干酪乳杆菌 从开菲尔分离的K1C菌株在(车前草最低培养基)PMM5肉汤中培养[17]厌氧地在37°C持续48h。的无细胞培养上清液 干酪乳杆菌根据Saadatzadeh描述的方法制备 等。 [18]。简而言之,将培养基于4000离心×g 15分钟。使上清液通过无菌的0.22μm孔径过滤器(德国萨托里乌斯)。将滤液的冷冻干燥/甲醇提取物干燥并保存在4密闭的容器中°C.

固定浓度和量的甲醇提取物(10μ将L 10 mg / ml的溶液点在预涂硅胶60 F254板上(Merck,Darmstadt,德国)。该板用甲醇:氯仿(3∶2)溶剂体系显影。将显影的板风干并在紫外线(UV)和可见光下观察。为了筛选抗氧化剂能力,将显影的风干板浸入0.1%DPPH抗氧化剂的甲醇溶液中,并将板风干。在风干的TLC板上,紫色背景上的活性抗氧化剂成分被检测为淡黄色斑点。 Rf 确定所有检测到的活性抗氧化剂成分的值[19]。

具有相同R的分数f 从20个板中收集价值。将收集的样品溶于HPLC级甲醇中,并以12000rpm离心15分钟(Hettich Universal,德国)以除去二氧化硅,然后将甲醇提取液在40℃以下的旋转式(德国Heidolph)中干燥。°C.称量残留物,以确定用于抗菌测定的每个馏分的量[20]。

 

活性成分的部分表征

发酵48 h后从PMM5上清液甲醇提取物的TLC中提取的抗氧化半纯化组分。 乳杆菌 凯西 使用Jayashree(2013)的标准方法测试了菌株K1C是否存在不同的化合物。简而言之,为检测薄层色谱中的碳水化合物,肽,酚和多酚,酚和单宁,碱性和萜类化合物,分别使用了以下试剂:本尼迪克特’s试剂,茚三酮,福林–Ciocalteu, FeCl3 2%,NaOH 2%和氯仿-H2所以 4 [21]。 

 

壳聚糖纳米粒子的制备

壳聚糖纳米颗粒(CS NPs) 根据易卜拉欣描述的改良方法制备 等。 [22]。为了优化纳米颗粒的制备,每次使用不同的乙酸浓度,pH值和三聚磷酸盐五钠(TPP):壳聚糖的比例。简而言之,制备浓度为0.1-1.5%(w / v)的壳聚糖溶液在乙酸(0.5%)中的溶液,并将该溶液的pH调节至4-5.5,并在500℃下连续搅拌。×g,室温放置24小时。将壳聚糖溶液滴加到TPP溶液中(0.1-1%),同时连续搅拌(IKA RH basic 2,德国)。将制备的纳米颗粒进行20W超声处理9分钟。纳米粒子在16000离心×持续30分钟,分成等分试样,用于壳聚糖稳定性实验。

 

具有抗菌活性的壳聚糖抗氧化剂纳米粒子的制备

载有抗氧化剂的壳聚糖纳米颗粒的制备方法与CS NPs相同,只是将抗氧化剂-抗菌级分以1mg / ml的浓度预先溶解在TPP溶液中[22]。

 

颗粒形态的测定 通过扫描电子显微镜

通过扫描电子显微镜(SEM)(Tescan,Vega3,USA)进行了颗粒形态的研究。将干燥的颗粒放入一条黑色胶带中,并附着在样品架上。在低真空下检查颗粒形态。

 

 

壳聚糖纳米粒子的收率%

由回收的干燥纳米颗粒的重量和起始原料的初始干重之和计算出的壳聚糖纳米颗粒的百分产率如下平衡[23]:

 

CS NP的耐久性

将新鲜制备的CS NP于16000离心×g在存放之前30分钟。超速离心后,将获得的沉淀物悬浮在pH值磷酸盐缓冲盐水(PBS)中 7.4。在预定的存储时间(0、1、2、3、4和5周)和37时测量体重减轻°C.以特定的时间间隔从PBS中取出样品,并用蒸馏水洗涤。干燥后的纳米颗粒重量在45的烤箱中保持过夜°C根据以下公式计算:

 

哪里,Wi 是初始质量,Wt 是时间t的剩余质量。所有结果均为两次重复的平均值[24]。

 

体外药物释放研究

通过将纳米颗粒在5 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中于37°C下温育来确定抗菌物质从CS NPs的释放°C.将载有抗菌组分的CS NP悬浮在Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)中,并以100的搅拌速度放置在振动培养箱中 × g at 37°C(伊朗帕兹阿玛)48 h at 37°C.以预定的时间间隔(24、48、72、96和120h),将样品于15000离心 × g for 30 min at 10°然后,倒出上清液。用紫外可见分光光度计(Labomed,美国)在波长为250nm的波长处分析上清液中释放出的抗菌成分的量,在该波长处,抗菌成分的吸光度最高[25]。对于每个测量,分析一式三份的样品。

 

抗菌测定

根据CLSI规程,使用微孔稀释法确定了分离的抗菌级分,CS NP和载有细菌的CS NP对病原细菌的最小抑制浓度(MIC)值[26]。而在MIC分析中,将测试样品进一步稀释,范围从1000到2μg/ml.

大肠杆菌 ATCC 11303和 金黄色葡萄球菌 选择ATCC 6538作为指示病原菌是因为它们是伤口感染中最常见的细菌,分别代表革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。所有实验均一式三份进行,氯霉素用作标准抗生素。

 

结果与讨论

壳聚糖纳米颗粒具有许多优点,因此被用作药物输送载体。此外,纳米级颗粒和吸收增加效应显示出改善药物生物利用度的能力[27-30]。

在CS NP准备期间, 将壳聚糖溶液逐滴添加到搅拌的TPP溶液(0.1-1%)中后,目测分析了三种不同的悬浮液,包括:乳白色悬浮液,透明溶液和聚集体。乳白悬浮液与非常小的颗粒的悬浮液相关,在图1中显示为不同CS和TPP浓度的组合。该乳白色悬浮液的CS和TPP终浓度为0.1–分别获得1 mg / ml和0.5 mg / ml的纳米颗粒尺寸(表1)和使用0.5 mg / ml TPP(表2)和不同的壳聚糖浓度(mg / ml)制备的CS-NP的产量ml)如图1所示。

图2显示了CS-NP和载有抗菌素的壳聚糖纳米颗粒的SEM图像。

 

 

Xu和Du研究了通过TPP和CS的离子凝胶化制备的壳聚糖纳米颗粒的不同配方。根据他们的TEM结果,Cs-NP的直径在20至200nm之间。 Pan等。报告指出,壳聚糖纳米粒子的粒径在250-400 nm范围内,与我们的结果一致,该结果小于500nm [31]。先前的研究表明,负载的纳米颗粒通常会比空的纳米颗粒产生更大的尺寸,并且尺寸小于500 nm is suitable [32]。

通过离子凝胶形成的Cs NPs的机械强度很弱,因此限制了它们在药物递送中的使用[33]。为了提高壳聚糖的稳定性,使用了几种策略,包括在制备过程中添加稳定剂(如抗氧化剂)。

可以通过两种方法进行纳米颗粒系统中的药物加载,即,在产生颗粒之后(温育)和在形成颗粒期间(掺入)。在这两个系统中,药物分别吸收在表面上或物理上插入基质中。通过在颗粒形成过程中掺入药物,可以实现最大的药物负载[ 34]。在目前的研究中,三种抗氧化剂组分(Rf = 0.03,0.2,0.34)从 干酪乳杆菌 K1C菌株,只有一小部分(F1,Rf = 0.03)显示出萜类化合物的成分和对病原菌的抗菌特性,这些病原菌在制备颗粒过程中被掺入并嵌入Cs NPs中(掺入)。虽然,当将抗菌成分成功加载到纳米颗粒中时,预计粒径会增加,但是通过使用不同比例的Cs:TPP(1:5),加载的CS NPs的尺寸要比单独使用CS NPs(使用Cs: TPP为1:0.5),如图2所示。该结果表明Cs:TPP比对纳米颗粒尺寸具有重要影响。总之,CS和TPP浓度是控制CS NP粒径的参数,与Esmaeilzadeh-Gharedag​​hi等人的结果一致。 [35]。小于500的纳米颗粒 在TPP处可以获得nm: pH为4时CS重量比为5:1。

根据结果​​,在第5周加载抗菌的Cs NP在第1周显示出相同的Cs NP重量减轻(图3)。

发现储存温度和悬浮介质是可能影响CS NPs稳定性的因素。 Katas等。 (2013年)指出,CS NP不宜在室温下保存,因为它们易于降解,并且在4℃下保存时CS NP更稳定。°C [36]。 CS NPs在37岁时不稳定°C. 此外,CS NP在蒸馏水中的稳定性比PBS中更好,这可能是由于水分子和CS NPs的可电离基团之间形成了氢键[36]。因此,在这项研究中,为了研究CS NP和载有抗菌Cs NP的稳定性,在PBS中于37°C.

抗氧化剂-抗菌材料从20小时到120小时缓慢释放,导致释放少于20%(图4)。

根据Sunil等人的结果。 (2004年)在较低的pH值或较高的TPP溶液浓度下制备的壳聚糖微粒导致药物的缓慢释放[34]。另外,随着CS溶液的分子量和浓度的降低,药物释放增加。但是根据目前的研究结果,较高的TPP溶液浓度和降低的CS溶液浓度导致药物释放相对缓慢。

在这项研究中,由于载有抗氧化剂,这种载体的稳定性导致药物释放速度缓慢。

表3列出了CS NP,抗菌成分和载有Cs NP的抗菌检测结果。µ克/毫升) 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538和 大肠杆菌 ATCC 11303分别为2和0.5。

在这项研究中,在交联之前将抗菌级分添加到CS溶液中,但显示出较高的抗菌活性(MIC 60μ因此,可以得出结论,通过使用与预先形成的NP的孵育,可以提高负载部分Cs NP的抗菌活性。

壳聚糖的抗菌机制之一被解释为:壳聚糖与带负电荷的细菌表面结合,破坏细胞膜并改变其渗透性。因此,导致细胞死亡[37, 38]根据目前的研究结果,Cs NPs对革兰氏阳性细菌的抗菌活性高于革兰氏阴性细菌,这是由于它们的细胞壁不同。革兰氏阴性细菌中外膜的双层结构是针对外来分子的潜在屏障[37]。载有抗菌素的Cs NPs对MIC的影响最小 大肠杆菌 (60μ(g / ml),表明抗菌级分(MIC 500μg / ml)嵌入Cs NP(MIC 2500μg/ml).

 

结论

药物递送系统是利用壳聚糖的广泛研究的领域之一,因为壳聚糖截留特定药物的效率及其控制药物释放的能力。尽管在药物递送或组织工程系统中使用壳聚糖具有巨大的潜力,但其长期稳定性差是壳聚糖药物应用规模扩大的主要缺点。为了提高壳聚糖的稳定性,在制备过程中将具有抗菌特性的抗氧化剂组分添加到Cs NP中。 Cs NPs与从中分离的抗氧化剂-抗菌成分的组合 干酪乳杆菌 增加Cs NPs的稳定性和级分的抗菌活性也大大提高。这项研究表明,将CS NPs的货架期和抗菌特性可以通过掺入从 卡西乳杆菌 通过结合到CS NP中,该级分的抗菌活性也增加了。

而且,在纳米颗粒形成期间,优化了理想条件,例如pH和壳聚糖/ TPP比。总之,分离的抗氧化剂-抗菌组分可用于改变壳聚糖纳米颗粒的化学稳定性和生物降解率,从而有可能用作具有较高使用寿命和较高抗菌活性的伤口敷料。

致谢

这项工作的经费来自伊朗Alzahra大学。

 

利益冲突

作者声明没有利益冲突

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