基于聚氨酯的纳米纤维三尖瓣支架在心脏瓣膜组织工程中的制备与表征

文件类型:原始研究文章

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1 德黑兰医科大学医学先进技术学院医学纳米技术系,伊朗德黑兰

2 德黑兰医科大学先进技术学院组织工程系,伊朗德黑兰

3 德黑兰医科大学医学先进技术学院医学生物技术系,伊朗德黑兰

4 哈佛大学工程与应用科学学院综合科学与工程实验室,牛津大学,剑桥9牛津,马萨诸塞州02138

5 德黑兰医科大学德黑兰心脏中心心血管医学先进技术研究中心,伊朗德黑兰

抽象

目标: 组织工程学代表了一种新方法,可通过提供具有生长和重构能力的可行瓣膜假体来解决当前心脏瓣膜置换术的并发症。在该项目中,采用静电纺丝和浸涂技术从医用级聚氨酯(PU)制备心脏瓣膜结构。
方法: 首先,将三尖瓣模具除其瓣膜部分外浸入PU溶液中。然后,将PU纳米纤维电纺在浸涂模具上以形成阀门。 通过SEM研究了纳米纤维的形态和直径,并进行了接触角测量以评估支架的润湿性。此后,使用拉力试验机评估纳米纤维支架的机械性能。然后,在支架表面上培养HUVEC细胞系。
结果: SEM图像显示了所制备支架的适当的纳米纤维结构。另外,获得的结构显示出适当的拉伸性能。根据直接和间接MTT,DAPI染色和SEM结果,纳米纤维具有生物相容性,并且细胞可以适当地附着在支架表面。
结论: 这项研究证明了用于工程人造心脏瓣膜的聚氨酯基纳米纤维支架。所提出的支架在细胞外基质(ECM)产生之前为细胞提供了暂时的支持。 

图形概要

基于聚氨酯的纳米纤维三尖瓣支架在心脏瓣膜组织工程中的制备与表征

关键词


介绍

在工业国家和发展中国家,心脏瓣膜疾病的患病率正在增加。终末期瓣膜功能障碍的一般治疗方法是更换心脏瓣膜[1-5]。已知三种类型的瓣膜可替代心脏瓣膜结构,包括机械瓣膜,生物修复瓣膜和聚合物瓣膜。 尽管机械心脏瓣膜具有很高的刚度和耐用性,但这类瓣膜仍具有诸如生物相容性差,血栓形成和血栓栓塞的缺点,以及由于长期抗凝治疗而导致出血的风险[6,7]。进行异体移植或同种异体生物人工心脏瓣膜置换术的患者不需要抗凝治疗,因此不会招致抗凝相关出血的风险,但是进行性结构恶化是该手术的主要关注点[6,8]。另外,聚合物心脏瓣膜的开发研究也在进行中[9]。但是,这三种心脏瓣膜置换术的主要缺点是它们无法生长和重塑。

心脏瓣膜组织工程学是一种克服其他方法局限性的新方法,能够促进患者新瓣膜的生长,重塑和修复[6,10-13]。

一般的心脏瓣膜组织工程涉及植入前的支架制造,细胞整合和生物反应器调节[14]。为了模仿天然心脏瓣膜的结构,已经尝试了不同类型的支架。研究了两种主要的脚手架: 首先,来自异体/异种来源的无细胞心脏瓣膜支架,其次,由合成和/或天然(生物)聚合物构建的人工支架[15]。可以将考虑的支架进一步分为多孔,纤维和水凝胶类型[16]。由于缺乏模仿天然心脏瓣膜的形状和柔韧性的能力,因此制作的3D多孔支架的应用受到了限制[16]。水凝胶显示出较弱的机械性能,并且随着细胞的加入,其硬度降低[17-19]。纤维支架在细胞粘附,迁移,增殖和分化方面表现优异,它们是组织工程应用中的重要因素[20-26]。因此,纤维支架有望提供合适的再生心脏瓣膜。

最近的研究表明,电纺聚氨酯(PU)纤维是软组织工程[27],血管移植物[28,29]和促进神经元分化的支架[30,31]的合适候选者。同样,将电纺聚氨酯纳米纤维应用于心血管组织工程也取得了可喜的成果[32,33]。 2009年,莫秀梅等。提出了一种新颖的静电纺丝和快速原型(RP)融合沉积建模(FDM)组合方法,该方法被建议用于组织工程心脏瓣膜支架的制造。 [34]。他们的同事比较了他们的种子在合成喷涂聚氨酯纤维上的行为,并证明了聚氨酯支架的生物相容性[35]。近来,弹性体聚(酯氨基甲酸酯)尿素被电纺到旋转的锥形心轴上。通过使锥形心轴的半径与天然肺动脉瓣的曲率半径匹配,电纺丝构造物表现出类似于天然小叶的曲线纤维结构[36]。虽然用纳米纤维覆盖结构表面可以改善细胞的增殖和扩散,但是它需要一个支撑性骨架来形成相应组织的宏观结构。在心脏瓣膜组织工程的情况下,许多研究已经合成了复杂且异质的材料来构建纳米纤维的背景。      

在这项研究中,聚氨酯溶液的纳米纤维已成功电纺并通过SEM,接触角测量和拉伸试验进行了表征。然后,通过培养HUVEC细胞以及直接和间接MTT测定法评估纳米纤维支架的生物相容性。此外,通过SEM研究细胞-纳米纤维的粘附。最后通过电纺和浸涂相结合的方法构建了主动脉心脏瓣膜支架,从而通过浸涂的方式合成了骨架的骨架并被聚氨酯纳米纤维覆盖。 

   

 

材料和方法

静电纺丝

为了制造聚氨酯纳米纤维,通过溶解3 w / w%的医用级聚醚基PU(TecoflexTM值 ,SG-80A购自路博润美国),以50:50的氯仿和甲醇的混合物购自默克公司。 (德国)[37]。均质化3小时后,将溶液转移到带有23号不锈钢套管的注射器中。改变静电纺丝的条件(伊朗德黑兰,FNM公司)后,当向静电纺针施加的电压为20 kV,针头与集电极的距离为100 cm和聚合物溶液的流速时,已获得最佳纳米纤维通过注射泵施加的剂量为1ml /小时。两种心轴用于收集纳米纤维:(1)旋转圆柱心轴用于形成纳米纤维片。 (2)由伦敦大学学院(UCL)设计和制造的旋转心脏瓣膜模具用于合成纳米纤维心脏瓣膜。

 

形态和纤维直径表征

在用金溅射之后,使用扫描电子显微镜(SEM,AIS 2100,Seron,South Korea)评估获得的纳米纤维垫的直径和形态。然后,随机选择每个图像中的30根纤维,并通过Image J软件(Sun Microsystems,美国)测量纤维的平均直径。

 

 接触角测量

 通过观察水的接触角,研究了纳米纤维支架和薄膜的表面亲水性。通过分配4来评估接触角μl滴在样品上并分析液滴形状。每次测量至少重复三遍。

 

细胞培养和活力测试

培养人脐带静脉细胞(HUVEC)以评估对纳米纤维支架的反应。已选择HUVEC细胞来模拟主动脉心脏瓣膜的内皮细胞(伊朗巴斯德研究所)。将细胞接种在75cm2的组织特异性烧瓶中2 并在DMEM-F12(GIBCO)中培养,并补充10%胎牛血清(FBS)和1%pen / strep(GIBCO)。同样,所有细胞瓶均在37°C和5%CO2气氛下孵育。为了收集细胞,将1 ml胰蛋白酶-EDTA(Sigma-Aldrich)添加到烧瓶中,温育10分钟后,用新鲜培养基停止胰蛋白酶消化。

 

细胞活力

根据SEM结果,乙醇70%破坏了纳米纤维的表面形态。因此,通过将支架在紫外线辐射下灭菌20分钟来完成灭菌。接下来,将支架用含有5%庆大霉素的PBS洗涤几次。然后将灭菌的支架置于96孔培养皿中。在完全培养基中制备HUVEC细胞悬液后,10/000–在每个孔中接种12/000个细胞。细胞的温育时间被认为是24、48和72小时。 然后,我们使用直接MTT,这是一种量热方法,用于评估支架上细胞的活力。孵育24、48和72小时后,提取上清液并100μ向每个孔中加入1毫升的5 mg / ml MTT PBS溶液,在37°C和5%CO2中孵育。 3小时后,在光学显微镜下在活细胞中在对照孔中可见甲maz晶体。因此抽出MTT溶液并将甲maz晶体稀释至100μl甲基磺酰胺(DMSO)。之后,将该溶液转移至空孔中,以在ELISA读取器中在570nm下进行分光光度法分析。与仅包含细胞的对照孔(TCP)相比,评估了纳米纤维上的细胞活力。此外,间接MTT分析被认为可用于更多的细胞毒性分析。为此,在对支架进行灭菌后,将纳米纤维垫放入孔中。然后将完整的培养基(89%DMEM培养基+ 10%FBS + 1%pen / strep)添加到装有支架的96孔板中,并在培养箱中放置10天。同样在另一个96孔板中,培养了HUVEC细胞。 10天后,用不同比例的新鲜和温育的培养基处理HUVEC细胞,其中将支架保存10天。 处理后,将细胞温育48小时,最后完成MTT方案。        

 

细胞核染色

如上所述灭菌后,将支架置于24孔培养皿中,将约70000个细胞接种在支架和空孔上作为对照,并孵育48小时。然后提取上清液,并用PBS洗涤孔3次。接下来,通过4%的多聚甲醛和20分钟将细胞固定在支架上。之后,再次用PBS和250洗脱孔μl of DAPI (5μg / ml)加入到每个孔中(DNA特异性荧光探针)。最后,将脚手架和对照孔洗净两次,每次500次μ1μlPBS附着在孔中。荧光显微镜(Optika,意大利)用于可视化支架和对照孔上的细胞核。

 

细胞与支架的相互作用

为了评估原始聚氨酯纳米纤维上HUVEC细胞的附着,延伸和形态,灭菌后,将约100.000个细胞在24孔培养皿中的支架上播种24小时。然后,提取细胞的上清液并用PBS洗脱两次。然后,将4%的多聚甲醛加入孔中,并在20分钟后用PBS洗涤2次。然后将四氧化放到装有孔的支架上,并在4°C下放置90分钟。制备用于SEM成像的装有细胞的支架的最后一步是通过不同浓度的乙醇进行脱水。但是如上所述,乙醇破坏了支架的表面。因此,脱水过程是通过冷冻干燥机完成的。

 

机械测试

使用单轴机械张力仪(型号STM-20,SATNAM,伊朗)测试了聚氨酯支架的纳米纤维和薄膜,以研究其机械性能。将样品切成50mm乘10mm的矩形条。为了测量反作用力,使用50 Kgf称重传感器以7 mm / min的延伸速率将样品拉伸至破坏。年轻’s模量,极限抗拉强度(UTS;峰值点处的最大应力屈服应力(Ys)(材料开始塑性变形的应力)和屈服应变(Yε)(代表屈服应力的应变)被测量并考虑在比较研究中。

 

心脏瓣膜的制造

在这项研究中,铝制的人工心脏瓣膜模具(由UCL设计和制造)被视为构建人工心脏瓣膜的模板。因此选择了两种方法:浸涂和静电纺丝。首先,以氯仿为溶剂制备7%w / w的聚氨酯溶液。然后将模具浸入聚合物溶液中,保持20秒,并从聚合物溶液中取出。之后,将模具保持在化学罩下直到其溶剂蒸发。在过程结束时,将可见的聚合物层涂覆在铝模具上。为了将模具上涂覆的聚合物的直径增加到1mm的厚度,该过程至少进行了10次。然后在小叶区域切割聚合物层。在下一步中,将涂覆的模具作为集电器固定在静电纺丝设备上。 因此,模具的所有侧面均应覆盖聚氨酯纳米纤维。最终,这种人造心脏瓣膜具有两种质地:每个区域除了聚氨酯纳米纤维外还有聚氨酯涂层,而在小叶区域仅聚氨酯纳米纤维。  

 

统计分析

结果计算为平均值±平均值的标准误。通过学生t检验和方差分析的重复测量(ANOVA)检验来分析数据。小于0.05的概率被认为具有统计学意义。

 

结果与讨论

这项研究包括三个主要部分:聚氨酯电纺纳米纤维的合成与表征,对支架的细胞反应以及最终的心脏瓣膜原型和机械性能的制造。

 

聚氨酯支架的合成与表征

聚氨酯的静电纺丝纳米纤维是在静电纺丝过程中合成的,其中PU聚合物溶解在氯仿/甲醇(50/50)中,然后进行静电纺丝过程(图1)。聚醚基聚氨酯TecoflexTM值 SG-80A是医用级聚氨酯,其在组织工程中的应用已得到研究。因此,上述聚合物薄膜具有生物相容性和可生物降解性[38-40]。为了生产这种聚合物的纳米纤维,建立了新的二元溶剂系统。这种氯仿/甲醇(50:50)溶剂体系似乎对合成聚氨酯电纺纳米纤维有益,因为氯仿-甲醇溶剂体系比通常用于制备聚氨酯溶液的HFIP或HFP便宜,并且比DMF更安全[42, 41]。根据SEM结果,所需的聚氨酯纤维具有多孔结构,其直径可提供合适的基质来生长内皮细胞[43、44]。测量了优化纤维的平均直径153±与高孔隙度互连的4 nm。应该提到的是,通过改变溶液浓度和二元溶剂的比例以及一些电纺丝参数,包括施加电压(kV),喷嘴到收集器的距离(cm)和聚合物溶液的流速(ml /小时),可以达到最佳的纤维毡。最佳纤维定义为:(1)最窄的纤维;(2)泰勒锥的稳定性;(3)可旋转至少一分钟;(4)在扫描电子显微镜(SEM)上验证最小的液滴和/或珠子数量) 图片。测试了接触角测量结果,以区分薄膜和聚氨酯纳米纤维的亲水性为82±2 º and 125±7º,分别(图2)。关于结果,溶液浇铸PU的CA扩展到82±2接近其他人的报告[45,46]。相比之下,PU薄膜浇铸是天然电纺纳米纤维的CA,据报道125±7,显示量明显更高。而且,该结果与其他研究相当[47]。可能的原因可能是,纳米纤维的形态起着最终的水滴作用的界面的作用,这是多个PU和空气接触点的组合,并且获得了疏水性更高的基质[48]。