硅纳米粒子表面两性离子涂层表面化学改性对预防蛋白质电晕的影响:试验研究

文件类型:原始研究文章

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沙希德·贝希什蒂大学药用植物与药物研究所植物化学系,伊朗德黑兰

抽象

Objective(s): The purpose of this study was investigation of the 蛋白电晕 formation on the surface of zwitterionic nanoparticles when they exposed to bio-fluid like human plasma.
方法:以两性离子表面包覆的二氧化硅纳米粒子,半胱氨酸和磺基甜菜碱为两性离子配体,合成并对其理化性质进行了表征。为了探测蛋白质电晕的形成,将合成的纳米颗粒在37℃下孵育°在人血浆溶液(10%和55%(v / v))中保持1小时。
结果:我们的结果表明,在用人血浆处理并消除松散附着的蛋白质后,纳米粒子的大小和Zeta电位没有显着变化。与人血浆温育后,两性离子纳米粒子的大小保持在100 nm左右,其zeta电位接近零。与血浆孵育后,纳米颗粒的凝胶电泳和MALDI-TOF质谱分析结果表明两性离子纳米颗粒与蛋白质不相互作用。
Conclusions: Our observations confirm the hypothesis that zwitterionic surface modified nanoparticles could provide the potential to regulate the interaction of the nanomaterials with biological systems and successfully overcome the 蛋白电晕 issue in the field of nanomedicine.

关键词


介绍

纳米医学领域和工程纳米颗粒(NPs)的使用面临的一大挑战是蛋白质暴露于血液等富含蛋白质的介质后会吸附在NPs表面,导致在NPs表面形成一层蛋白质层。“protein corona”并改变了NP的生物命运[1-4]。

特别是在最近几年中,许多出版物已经描述了有效且方便的方法,可以使用不同的靶向配体(如抗体,肽和适体)修饰NP的表面,从而提供智能的纳米载体,以识别靶细胞表面上靶细胞表面上的特定受体作为适用的纳米载体。在药物输送系统中[5-7]。

当蛋白质在体内注入生物环境时,蛋白质在NPs表面的非特异性吸附是造成体内和体外结果差异的主要原因。如果在NP表面形成蛋白质电晕,则任何在NP表面改造的配体都可能掩盖并导致肝,肾或脾脏误靶向或意外清除[8-12]。

已经探索并报道了许多方法来阻碍累积的蛋白质电晕的影响。一种方法是设计具有防污性能的表面涂层。避免非特异性吸附的最著名涂层之一是不带电荷的聚乙二醇(PEG)。虽然,甚至在涂有PEG的表面上也观察到某些某些血浆蛋白(如纤维蛋白原,IgG和载脂蛋白E)的吸附,尤其是在生物学条件下[13-16]。

最近,Rotello等人已经用两性离子涂层进行了表面化学改性。等提供具有高生物相容性,低毒性和长循环时间的无电晕NP。在我们之前的报告中,为了减少在存在生物介质的情况下主动靶向工程化NP的蛋白质电晕问题,我们研究了两性离子包被的NP,它们携带特定的靶向配体[17-22]。

考虑到这些原因,必须使用两性离子包被的NP才能解决纳米医学应用中的蛋白质电晕问题。在本文中,为了扩展我们以前的研究,我们研究了两种具有不同结构的两性离子改性二氧化硅NP的蛋白质吸附行为,半胱氨酸和磺基甜菜碱被用作两性离子配体,并且存在不同百分比的人体血浆。  

我们比较了两性离子二氧化硅-NPs和裸二氧化硅-NPs(未修饰的NPs)的理化性质,例如与人血浆孵育前后的流体力学尺寸和ζ电位。此外,通过凝胶电泳和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MALDI-TOF MS)研究了蛋白质在NPs上的吸附。

 

材料和方法

用料

除非另有说明,否则所有化学药品均购自Sigma-Aldrich。该化学品按原样使用。

 

裸露二氧化硅NP(Bare-SiNPs)的合成

根据Stὄber方法(23)制备裸硅NP。简要地说,要生产直径为100 nm的二氧化硅NP,请使用原硅酸四乙酯(TEOS)(62.5µ将L)添加到由甲醇(1mL),去离子水(0.36mL)和浓氨水(0.1mL)组成的混合物中。将混合溶液搅拌2小时。

 

S-(烷基氨基甲酰基)-L-半胱氨酸的合成 1)

L-半胱氨酸盐酸盐一水合物在70干燥°C保持12小时。将干燥的物质(2mmol)溶解在二甲基甲酰胺(4mL)中,并用3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基异氰酸酯(TEPI)(2.1mmol)处理。将搅拌溶液的反应在室温下放置3天,然后用DMF洗涤固体产物(方案1),更多细节请参见我们先前的研究[22]。

 

3-(二甲基(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基)-氨)丙烷-1-磺酸酯(配体2)的合成

配体2的合成根据Schlenoff 等。 [24]。在N 2下,向在15mL干燥的四氢呋喃(THF)中的1.7mg(14mmol)的丙烷内酯中逐滴添加14mmol的(N,N二甲基-3-氨基丙基)三甲氧基硅烷。
将反应在50℃下剧烈搅拌2小时。白色沉淀产物无需另外纯化即可使用,并在氮气下保存。反应产率为86%(方案2)。

半胱氨酸结合的二氧化硅纳米粒(Cys-NPs)和磺基甜菜碱结合的二氧化硅纳米粒(SB-NP)的合成

为了修饰Bare-SiNPs的表面并产生Cys-NPs和SB-NPs,分别将配体1(0.009 mmol)和配体2(0.01 mmol)添加到两个单独的Bare-SiNPs批次中,并将反应搅拌12 h (所有步骤均在图1中进行了说明)。然后,通过离心收集所有类型的SiNP,用去离子水洗涤(3×1 mL),然后重新分散在去离子水中。将NPs置于分子量为3.5K的截止渗析膜中,并在水中50%甲醇中透析48小时,以去除过量的氨。最后,将样品在室温下保存在黑暗的地方以进行进一步分析。

 

PBS中合成的Si-NPs的表征和胶体稳定性测试

使用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)和Zeta电位(Malvern Zetasizer Nano-ZS90),按照尺寸对所有类型的制备的SiNP进行表征。为了评估合成的SiNP的胶体稳定性,通过DLS在PBS缓冲液中测量NP的大小。

 

合成的NP与人血浆的相互作用

要制备样品HP10和HP55,所有NP的水溶液(100μL,在去离子水中1 mg / mL)与900混合μL人血浆(HP)溶液(分别在PBS中的10%HP和在PBS中的55%HP);制备的溶液在37℃下孵育°C保持1小时,并通过离心和PBS两次洗涤步骤消除了多余和松散附着的蛋白质,然后测量了它们的大小和Zeta电位。

 

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

通过SDS-PAGE分析来自先前步骤的所得样品,以确定吸附为不同类型NP的电晕成分的蛋白质。用人血浆处理后的样品用PBS洗涤两次,重悬于蛋白质缓冲液中,于100℃煮沸5分钟°然后,将相同体积的每个样品装入12%聚丙烯酰胺凝胶中,然后在120 V和80 mA下运行约100分钟。使用标准硝酸银方案将凝胶染色。

 

MALDI-TOF质谱分析

为了分析SiNPs表面吸附的蛋白质谱,将经过人体血浆处理和洗涤步骤后得到的NPs与等体积的芥子酸/α-在含有0.1%TFA的50%ACN中的-氰基-4-羟基肉桂酸,然后点在MALDI-TOF板上并风干。用MALDI-TOF质谱仪(Applied Biosystems 4800 MALDI TOF / TOF,Nd:YAG 200-HZ激光)分析蛋白质谱。标准协议用于调查和优化所有步骤。在两个受限的质荷比(m / z)范围内获得了独立的光谱,对应于分子量为1-10 kDa(“ <4kD”) and 10-180 kDa (“>4kD”),线性模式(正离子),经过专门优化的仪器设置。每个光谱是对每个样品的每个m / z片段进行1000次激光照射的结果,是在矩阵光斑表面上三个不同位置的每组中以三组100张(以20 Hz的频率)拍摄的结果。

 

结果与讨论

裸SiNP,Cys-SiNP和SB-SiNP的合成与表征

制备了具有隐形性能的工程硅胶NP,并将其行为与Bare-SiNP进行了比较。半胱氨酸,天然相容的氨基酸和磺基甜菜碱基团被用作小的两性离子涂层。合成了三种类型的100nm二氧化硅NP(SiNP),包括未修饰的SiNP(Bare-SiNPs),半胱氨酸包被的(Cys-NPs)和磺基甜菜碱包被的(SB-SiNPs)。由于Bare-SiNPs表面上的硅烷醇基团,这些纳米颗粒可以用所需的硅烷偶联剂适当地官能化;拟议的NPs是通过Bare-SiNPs的表面改性直接与所得的硅烷偶联剂通过配体1和2的化学偶联而制得的(见图1,方案1和2)。合成的SiNPs还通过动态光散射(DLS),ζ电位(ZP)和透射电子显微镜(TEM)进行表征,以观察流体动力学尺寸,表面zeta电位和尺寸分布(图2和表1)。结果证明形成具有均匀尺寸分布的纳米颗粒。通过DLS测量的整个合成NP的多分散指数(PDI)值均低于0.1。 Zeta电位测量表明,未涂覆的SiNPs(Bare-SiNPs)和两性离子涂覆的SiNPs的表面带负电,具有明显不同的值。 Bare-SiNPs的表面改性大大降低了覆盖了全部硅烷醇基团的二氧化硅NPs表面的负电荷,从而确认了成功的官能化。

通过DLS评估了PBS缓冲液中合成的SiNPs的胶体稳定性(表1)。结果表明,具有不同表面化学性质的Si-NP之间具有不同的稳定性。在这方面,Cys-SiNP和SB-SiNPs表现出最高的稳定性(无聚集体),而Bare-SiNPs在PBS中形成大量聚集体。根据我们的观察,我们可以强烈建议用两性离子化合物修饰NP的表面化学可以显着增加NP的胶体稳定性,这对于工程化NP的生物学应用而言非常重要。

 

合成的SiNP与人体血浆的相互作用

将所有三种类型的合成SiNP(即Bare-SiNP,Cys-SiNP和SB-SiNP)在模拟人血浆(HP)(10和55%(v / v))的溶液中于37°C孵育1h。体内和体外条件下的蛋白质浓度。测量了三种类型的SiNP的样品大小和Zeta电位(表1)。为了说明两性离子NP(Cys-SiNP和SB-SiNP)是否为具有蛋白质富集介质的非相互作用NP,进行了凝胶电泳;对于凝胶电泳,我们在与人血浆孵育和洗涤步骤后使用了所有NP的样品。正如预期的那样,检测到具有不同表面化学性质的NP的蛋白质吸附模式存在巨大差异(见图3)。观察到的蛋白条带证实了Bare-SiNPs表面上形成了蛋白电晕。相比之下,具有两性离子配体的NP(即Cys-SiNP和SB-SiNPs)显示出无/可忽略的蛋白带,从而证实了其抑制蛋白电晕形成的有趣能力。值得一提的是,在Cys-SiNPs的情况下,观察到的轻蛋白带可能与蛋白质在离心中的捕获有关,这会导致在两个人体血浆水平(10%和55% ),而这些变化约为3 nm,表明两性离子NP在屏蔽蛋白电晕中的行为不同。

 

评估合成的NP’MALDI-TOF质谱法吸附蛋白质

可以通过MALDI-TOF MS以敏感度和分辨率直接确定NPs表面吸附的多肽和蛋白质的存在及其分子量,这将使其成为进行血清/血浆蛋白谱分析的一项出色技术(25、26)。为了评估两性离子NP是否不与蛋白质相互作用,通过MALDI-TOF质谱分析了所有类型的合成SiNP与人体血浆温育并去除了游离的未结合和松散附着的蛋白质后得到的NP。为了评估分子质量的大范围和小范围,我们品尝了两种基质α-氰基-4-羟基肉桂酸和芥子酸。有趣的是,与Bare-SiNPs相关的蛋白质电晕光谱与与两性离子SiNPs相关的蛋白质电晕光谱完全不同。从图4中可以看出,一些蛋白质吸附在Bare-SiNPs的表面,这与SDS-PAGE中观察到的蛋白条带不一致。相反,对于两性离子SiNP,未观察到峰(检测到基线周围强度为3.5的嘈杂光谱)。

 

结论

总之,研究了两性离子涂层对二氧化硅纳米粒子进行表面化学修饰对纳米粒子在暴露于生物环境中防止蛋白质电晕形成的能力的作用。我们的观察结果表明,不同的两性离子NP具有不同的排斥蛋白质吸附的潜力。我们希望这样的研究可能会通过合成的工程化NP与生物环境的直接接口而为探查纳米生物界面的基本性质开辟新途径,而不会依赖于蛋白质电晕的形成。

 

致谢

这项工作得到了伊朗国家科学基金会(INSF)的资助(93028437)。

 

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

23.易卜拉欣IA,齐克里A,沙拉夫。球形二氧化硅纳米粒子的制备:斯托伯二氧化硅。 J Am Sci。 2010; 6(11):985-9。