纳米胶束和游离姜黄素对癌细胞和正常细胞的细胞毒作用研究

文件类型:原始研究文章

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1 伊斯兰阿扎德大学马什哈德分校理学院生物系,伊朗马什哈德

2 马什哈德医科大学医学院生物医学与纳米技术系,伊朗马什哈德

3 马什哈德医科大学药学院药物纳米技术系,伊朗马什哈德

4 马什哈德医科大学制药技术研究所生物技术研究中心,伊朗马什哈德

抽象

抽象
姜黄素是作为天然多酚衍生自姜黄根茎(姜黄)的一种基本亲脂性分子。这种常用物质在食品中用作香料和着色剂,并含有有效的抗氧化剂以及抗炎和抗增殖的肿瘤活性。姜黄素的开发的纳米胶束制剂用于促进上述亲脂分子的生物利用度和溶解度。本研究旨在通过使用基于四唑鎓染料的检测方法,通过使用不同的癌细胞和正常细胞来检查纳米胶束和游离姜黄素的抗增殖活性。为此,用纳米胶束或游离姜黄素以5、10、20、30和40的不同浓度处理各种细胞系µM for 48 h at 37 ºC.我们的结果表明,对于不同的癌细胞系,姜黄素胶束形式的最大半数抑制浓度与其游离形式所测得的水平一样高,但在正常细胞中,纳米胶束的毒性低于姜黄素的游离形式。

关键词


介绍

姜黄素oids are a class of natural polyphenolic compounds derived from turmeric (Curcuma longa), which belong to the Zingiberaceae (ginger family). Among them a yellowish compound, curcumin, is the most abundant composition and one of 最活跃 constituents of turmeric (1, 2).

世界各地的传统医学,烹饪以及食品工业都广泛使用它。姜黄素已被引入具有一系列生物学效应,即“anti-inflammatory”, “antioxidant”, “抗菌,脂质修饰”, “anticancer”, and “anti-angiogenic” “(2-8).

近年来的各种研究表明,这类化合物可在动物的化学致癌物形成和诱导的肿瘤的引发和促进中充当有效的预防物质(3-5)。姜黄素已被许多研究人员报道为多种动物肿瘤的化学预防癌症,包括结肠癌(7、9),十二指肠癌(10),胃癌(2),前列腺癌(11)和乳房癌(12)。体外和体内。

它们显示出对人癌细胞具有一定的生长抑制作用以及凋亡诱导作用。而且,这些物质在正常细胞中靶向多种细胞信号传导途径而无毒性诱导(9、13)。有关更多信息,请深入阅读介绍姜黄素的文献, the most active 姜黄素,是用于癌症治疗的多种天然化合物的极佳替代品(14)。

根据许多报道,姜黄素还能够有效调节大量基因的表达,这些基因负责癌细胞的增殖,血管生成,侵袭和转移的各个阶段。此外,它能够通过阻断一系列信号转导途径来抑制肿瘤的进展和转移,包括“p53, Ras, Wnt‐β,MAPK,ERK,PI3K和Akt”在癌细胞中(2)。

据报道,该物质可通过多种机制(例如失活)影响CSC(癌症干细胞)。“转录因子和炎性细胞因子”或抑制各种蛋白激酶活性。其他机制包括调节负责炎症和肿瘤发生的酶的活性,抑制信号传导细胞因子的受体以及生长因子。而且,压制“黏附分子的表达” and inhibition of “抗凋亡蛋白和其他靶标”也被提及。根据一系列探索其安全性或毒性的临床试验,据报道,姜黄素用于达到最佳治疗效果的可接受剂量为每天4至8克,这是人类可耐受的剂量。另一方面,它强加“对神经干的毒性有限 Cells  (NSCs)”但表现出色“对CSC的细胞毒性作用”(2)。此外,姜黄素能够降低“circulating TNF-α”这是一种与不同细胞事件(例如免疫力,炎症,细胞存活和凋亡)相关的多功能细胞因子(15、16)。姜黄素也可以“癌症中的MicroRNA调节剂” (34-36).

姜黄素是姜黄素的主要成分,在人类临床试验中每天最多可处方8 g,而不受剂量毒性的限制,这一事实表明,姜黄素在预防和治疗癌症方面可能非常有效(17 ,18)。

但是,这些化合物的主要局限性是它们在水中的溶解度低(即姜黄素在pH 7.3下为0.0004 mg / mL)和在生理pH下的极度敏感性(14、16-20)。而且,在许多对小鼠,大鼠和人类进行的临床前和临床研究中,姜黄素的生物利用度较低(16)。在一项针对人类的研究中,口服10或12 g /天的姜黄素导致观察到血清中姜黄素水平为50 ng / mL。然而,这将姜黄素的血液循环利用率降至最低(19)。另一项研究表明,与使用游离姜黄素溶液相比,使用纳米胶束可大大促进体外细胞摄取和体内角膜渗透,并增强抗炎功效(2)。

在此背景下,进行本研究的目的是检查姜黄素的功效 癌症和正常细胞上的纳米胶束。

为此,研究调查了 “抗增殖作用» 通过基于四唑鎓染料(MTT)的分析,在十种不同的细胞系上分离出游离和姜黄素纳米胶束(表1)。

材料与方法

含有姜黄素的Nanomicelle已注册为SinaCurcumin®得自伊朗德黑兰的Exir Nano Sina Company(IRC:1228225765)。姜黄素粉购自Sami Lab Limited(印度卡纳塔克邦班加罗尔)。

此外,U-87-MG(人胶质母细胞瘤细胞系),NIH 3T3(小鼠胚胎成纤维细胞),A549(人胎肺成纤维细胞系)和Hela(人宫颈癌)购自伊朗国家细胞银行(伊朗德黑兰,巴斯德研究所)。此外,B16F0(黑素瘤细胞系)获自Sigma-Aldrich(美国)。在Dulbecco中维持上述细胞系 ’s改良的Eagle培养基(DMEM,Sigma),补充了10%(v / v)的胎牛血清(FCS)(Gibco,BRL),100 IU / mL青霉素和100 mg / mL链霉素,以及2 mM L-谷氨酰胺并在37孵育 ºC输入“潮湿的气氛” containing “5% CO2 and 95% air”.

TUBO是一种过度表达rHER2 /神经蛋白的克隆细胞系,由意大利都灵大学都灵大学临床和生物科学系的Pier-Luigi Lollini医生友情提供。该细胞系在补充有20%FCS的DMEM中培养。其他细胞系包括SK-BR-3(人类乳腺腺癌细胞),MDA-MB-231(人类乳腺癌细胞)和4T1(小鼠乳腺肿瘤细胞系),这些细胞购自伊朗国家细胞银行并在“包含25 mM HEPES的RPMI 1640培养基”, as well as “2 mM L-谷氨酰胺补充了10%(v / v)的热灭活” FCS, “100 IU / mL青霉素和100 mg / mL链霉素(均来自Gibco)”并在5%CO的潮湿气氛中孵育和95%的空气,在37 ºC。

细胞增殖测定

癌症和正常细胞增殖“各种浓度的纳米胶束和游离姜黄素的存在”通过MTT测定法(德国罗氏应用科学公司)测定。布里,“在指数生长期,用胰蛋白酶消化单层培养物”之后,使用锥虫蓝排除法对存活细胞进行计数。随后,将细胞接种于“96孔平底微量滴定板(SPL Life Sciences,韩国),细胞/孔的密度合适(200µL media/well)”.

温育24小时后达到85%融合度,细胞 用各种浓度的纳米胶束和游离姜黄素处理过。首先是一个标准“姜黄素的原液”(10 mg / ml)在超纯二甲基亚砜中制备,并用游离FCS介质稀释。将Nanomicelles直接在游离FCS培养基中稀释。然后,将纳米胶束和游离姜黄素以不同浓度添加到细胞中 (即5、10、20、30和40µM). 温育48小时后,将细胞用洗净两次“新鲜和免费的FCS培养基。随后,使用新鲜的含FCS的培养基去除纳米胶束或残留在细胞表面的游离姜黄素,然后将它们再次孵育48小时。添加此步骤是为了消除这些化合物对MTT的还原作用以及在最后一步中对光谱测量的干扰。孵育48小时后,将完全培养基替换为100µL包含10个的免费FCS介质µL MTT (在PBS中为5 mg / ml)。孵育细胞后“for 4 hours at 37°C”,用200精心替换了µL二甲基亚砜为了解决甲maz晶体。最后,借助分光光度计酶标仪(Bio Tek Elx。808),评估了光密度“波长为570 nm时,背景扣除为630 nm”。使用以下公式计算细胞的生存力:

细胞活力(%)= ×100

其中OD代表光密度。

结果与讨论

在本研究中,在不同的癌细胞上测量了姜黄素的游离和纳米胶束形式的时间依赖性细胞毒性。姜黄素的纳米胶束形式,新浪姜黄素®是由伊朗伊朗德黑兰的Exir Nano Sina Company销售的产品(IRC:1228225765)。姜黄素类化合物在纳米胶束中的包封效率几乎为100%。根据动态光散射,纳米胶束的平均直径约为10 nm。纳米胶束的姜黄素含量和尺寸分布至少持续24个月保持恒定。 SinaCurcumin的口服吸收量是小鼠中常规姜黄素散剂的至少59倍(21)

使用了不同的细胞系,包括4T1,HELA和SKBR3,TUBO,MDA-MB-231,J774,B16F0,U87-MG,A549以及正常细胞系NIH3T3(表1)。表1列出了姜黄素在48小时孵育时间内的最大半数抑制浓度(表示为IC50)。 μM ±标准偏差(SD),(n = 3)。如表1所示,药物的细胞毒性在不同的细胞系中有所不同,其中4T1最高,而正常细胞NIH3T3最低。同样,结果表明,除了游离和纳米胶束形式的姜黄素在NIH3T3细胞中的细胞毒性之间存在显着差异(p<0.007),在其他细胞系中没有观察到统计学差异。图1显示了两种不同形式姜黄素的IC50的比较。

不同的体外实验表明,高浓度的姜黄素对癌细胞具有细胞毒性作用。然而,口服后,由于其低生物利用度和广泛的代谢,因此在肿瘤微环境中从未提供这些浓度。因此,这限制了口服姜黄素类处方对癌症治疗的潜在影响。迄今为止,已开发出各种策略来克服这些局限性,并且对许多制剂进行了进一步研究以提高其溶解度并提高姜黄素的生物利用度,例如用胡椒碱处方姜黄素,姜黄素的合成类似物以及基于纳米技术的药物递送系统,其中包括姜黄素植物体,脂质体,聚合物纳米粒子等(22-28)。新浪姜黄素是最近 developed Nano Exir Sina Company(伊朗德黑兰)基于姜黄素的纳米胶束形式引入了姜黄素的配方。

各种体外实验表明,暴露于高剂量的姜黄素类药物的剂量范围为5–50 µM,癌细胞会死亡。本研究结果还证实了游离和纳米胶束形式的姜黄素,新浪姜黄素对多种癌细胞的不同细胞毒性作用。根据这些发现,在正常细胞系NIH3T3中观察到最高的IC50值,这意味着较低的毒性,这可能与这些细胞的姜黄素类药物较少的收获有关,因为它们的增殖速率较低。在该细胞系中,与游离形式相比,姜黄素纳米胶束的毒性明显降低(P<0.01),这可能与姜黄素从纳米胶束中缓慢释放导致药物缓慢收获有关。

如前所述,有大量报道证实姜黄素和其他姜黄素可能在某些条件下导致细胞死亡。 Goodpasture和Arrighi已经证明,在几种哺乳动物细胞系中,姜黄可能会引起剂量和时间依赖性的染色体畸变(29)。根据积累的数据,姜黄素诱导的DNA损伤和染色体改变的剂量与据报道发挥有益作用的剂量相似(30-35)。这些报告引起了人们的关注“curcumin safety”,由于“DNA alterations”在致癌中。有大量证据表明 «活性氧» (ROS)在其负面影响的分子机制中可能起重要作用。一些研究人员表明,尽管姜黄素在较低浓度下会诱导抗氧化作用,但在较高浓度下它可以增加细胞内ROS的水平(36-39)。“Two α,β-unsaturated”已知姜黄素化学结构中的酮基参与称为迈克尔加成的反应。在该反应中,这些不饱和酮基与“半胱氨酸残基的巯基”一系列蛋白质。它可以解释姜黄素通过不可逆的修饰产生ROS的原因“抗氧化酶硫氧还蛋白还原酶”,以及为什么它会导致其他蛋白质失活,例如拓扑异构酶II,肿瘤抑制蛋白p53并在高浓度时发挥其细胞毒性作用。 (27)。

  1. 结论

本研究的结果证实了姜黄素的游离和纳米胶束形式对正常细胞和癌细胞的细胞毒性作用。然而,应该指出的是,与游离姜黄素相比,纳米胶束对正常细胞的作用降低了,这一发现需要进一步研究以阐明姜黄素不同剂型诱导的可能机制。 such effects.

致谢

作者感谢马什哈德医科大学药学院纳米技术研究中心的财政支持。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 
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