表征和控制壳聚糖纳米颗粒中al蛇per蛇毒的载量作为佐剂和疫苗输送系统

文件类型:原始研究文章

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1 赞詹大学化学系,伊朗赞詹

2 沙鲁德医学院的医学学院医学纳米技术系,伊朗沙鲁德

3 伊朗卡拉伊市农业研究,教育和推广组织拉兹疫苗和血清研究所人类疫苗和血清部

抽象

这项研究的目的是设计和制备蛇毒(Vipera albicornuta)蛇毒负载的壳聚糖纳米粒子(CS-NPs),以及评估不同因素对蛇毒的包封效率(EE)和负荷能力(LC)的影响。 CS-NPs的形貌和特征分别通过扫描电子显微镜(SEM),傅立叶变换红外光谱(FT-IR)确定。 CS-NPs是基于三聚磷酸(TPP)和壳聚糖(CS)的离子凝胶法制备的。结果显示通过SEM观察,表面光滑,球形。负载的纳米颗粒的粒径为187nm,ζ电势为46.7mV。获得的最佳浓度400µg / ml的毒液,导致LC 86%和EE 94%。颗粒的结构研究表明毒液和CS之间的键。根据研究结果,可以得出结论,loaded蛇bi蛇毒载CS-NPs可以用作新的抗原递送系统。

关键词


介绍

壳聚糖(CS)在广泛的药物用途中显示出很高的潜力[1、2]。已经进行了许多研究来评估CS在设计缓释剂型(例如基质片剂)中的用途,并显示CS通常提供出色的缓释特性  体外,尤其是在形成凝胶基质的低pH值下[3,4]。最近已经对聚合物纳米粒子作为载体进行了药物和抗原的输送进行了大量研究[5,6]。 CS-NP被作为佐剂和疫苗输送系统进行了研究[7-9]。已经证明CS-NPs的吸收增强作用改善了粘膜免疫应答。 CS-NP改善抗原跨粘膜传递的机制可以使用前面有关经口给药部分讨论的相同理论进行解释[10,11]。研究人员成功地开发了包含流感,百日咳和白喉抗原的CS和CS-NPs疫苗用于鼻腔输送。他们发现疫苗在小鼠中产生了大量抗体,其中包括血清和分泌性免疫球蛋白A(IgA)[12-15]。除了粘膜递送疫苗的潜在载体外,据报道CS-NP还可以作为全身性疫苗递送的佐剂,例如使巨噬细胞和多形核细胞进一步增殖和活跃。一旦CS-NP被吸收,巨噬细胞就被激活[16-18]。如今,要生产抗蛇毒血清,通常通常通过肌内途径将抗原递送给马[19]。这些递送途径有几个缺点:引起副作用的抗原的高初始浓度。 另一个原因与多次注射的需要有关,因为只有极小部分的注射抗原到达受影响区域以诱导足够的免疫系统。因此,重要的是减少长时间免疫所需的重复毒液施用次数,并提高产量[7,20,21]。

因此,进行了这项研究,以研究许多因素对糖衣精的包封的影响。 bi蛇 并使用FTIR,DLS和SEM评估CS-NP的理化性质,这些CS-NP可用作新的抗原递送系统。

材料和方法

用料

源自虾壳(Pandalus borealis)的中等分子量(MMW)CS购自Primex Co(冰岛)。脱乙酰度最低为95%。三聚磷酸钠(TPP)和考马斯蓝G250由Sigma(美国)提供。磷酸(85%),乙酸和无水乙醇购自默克公司(德国达姆施塔特)。 bi蛇 由Razi疫苗和血清研究所(伊朗Karaj)提供的冻干粉末制成的蛇毒。其他材料均为制药和分析级,一经使用便被使用。

纳米颗粒制剂和毒液负载

CS-NPs是使用CS与TPP阴离子的离子凝胶技术制备的[22,23]。将不同浓度的CS(1.5、2.0、2.5、3.0 mg / mL)溶解在乙酸水溶液中。随后制备不同浓度的TPP溶液。最终,在室温下在恒定磁力搅拌(1100 rpm,1小时)下,将5mL的CS溶液逐滴添加到2ml的TPP溶液中。在上述条件下自然形成乳白色悬浮液。通过将悬浮液在11,200 g,14下离心分离纳米颗粒°C 30分钟。然后将冻干的纳米颗粒称重并保存在4°C–8°C.在这项研究中,不同参数的影响,包括毒液浓度(20、30、40、50、100、200、300、400、500、750和1000 μ评估了EE和LC上的TPP浓度(0.75、1和1.25 mg / mL)和CS浓度(1.5、2、2.5和3 mg / mL)。一旦评估了上述参数之一,其他参数便保持不变。

纳米粒子的形态和结构表征

在用金溅射之后,使用扫描电子显微镜(SEM)(INCA-500,英国)以15.0kv的加速电压进行形态和粒度的表征。从悬浮液中分离出的CS-NPs用冷冻干燥机干燥,并使用Bomem Spectrum上的KBr沉淀进行FTIR。进行动态光散射技术以测量颗粒’尺寸,尺寸分布[多分散指数(PDI)]和Zeta电位,使用Zetasizer(英国Malvern仪器公司)[24,25]。

毒液装载百分比

通过以11200 g和14的离心率将悬浮液中的毒液纳米颗粒从水性悬浮液中去除°C 30分钟。除去上清液,并通过Bradford蛋白测定分光光度法在585nm下测定上清液的蛋白质含量(游离毒液)。方程式1和方程式2用于分别计算纳米粒子的毒液LC和该过程的毒液EE。公式如下[26、27]:

LC =(A-B)/ C× 100 (1)

EE =(A-B)/ A× 100 (2)

A: 毒液总量; B: 游离毒液的量; C: Nanoparticle weight.

CS-NPs体外释放毒液的研究

将一定量的装有毒液的CS-NP悬浮在单独的试管中,该试管中含有等体积的0.2 mol / L PBS溶液(pH 7.4),并在37°C和600 rpm。在适当的时间间隔(1、2、4、6、10、22、34、48、72小时),取出一根试管的内容物,并以19,000 g和10的离心率离心°C持续35分钟。进行Bradford分析以测量释放的毒液量[28]。

结果与讨论

根据理化性质表征纳米颗粒

图1显示了纳米颗粒的形态特征。如图1A和图1B所示,颗粒的形状几乎彼此相似,具有光滑的半球形或近乎椭圆形的外观。根据DLS结果,CS和负载的CS-NP的平均粒径分别为155和187 nm。发现空的和负载的纳米颗粒的平均尺寸大于通过SEM确定的平均尺寸。与SEM相比,DLS技术可测量包括水合层和聚合物壳在内的颗粒的流体动力学直径,并且通常显示出较大的颗粒尺寸[29]。在SEM图像中看到的聚集体可以归因于样品制备过程中的干燥过程[30]。 CS的PDI值与载有毒液的纳米颗粒大致相同(0.500和0.577),这意味着在PDI中未观察到显着变化(表1)。

载有毒液的CS-NP的稳定性为 与Zeta电位有关[31]。颗粒’表面电荷有些正,CS zeta电位为46.7 mV,毒液为 负载的33.2 mV纳米粒子。这项研究的结果表明,静脉液负荷可导致Zeta电位轻微降低。静脉中涉及长链CS分子,并且不均匀。由于胺基和分子链之间存在静电排斥力,CS分子可能在溶液中采用扩散构象。在CS链的某些位置上,氢-胺基键可能由大分子上的羧基形成’的表面。然而,CS链仍保持其自身的紧凑三维结构,而不会在相对酸性的溶液中扩散,以保持其疏水性核[28]。因此,CS分子的正表面电荷不能被蛋白质分子的附着充分抑制。 CS链上仍可能有大量未占用的胺基[31]。

通过使用FTIR来检测离子胶凝过程形成载有毒液的CS-NP的潜力 毒液-CS相互作用。图2显示了CS-NP,载有毒液的CS-NP和毒液的FTIR光谱。在CS-TPP纳米颗粒中,宽峰在3000 cm-1–3500 cm−1 该范围与O-H拉伸和分子间氢键的结合峰有关,导致胺基的弯曲振动降低。与伯胺类似,N-H拉伸在相同区域重叠。在3420厘米处的粘合-1 is related to to NH2 和OH基拉伸CS中的振动。高峰约1075厘米-1 与C-O-C的对称拉伸有关,通常在1000至1300 cm之间出现-1 和1320厘米-1 代表C-N拉伸振动。 1000厘米以下的其他峰-1 与CS多糖结构有关。此外,交联的CS表明在1157cm处有P = O峰。–1 [12]。这些结果可能来自磷离子和铵离子之间的联系。因此,可以认为TPP的三聚磷酸基团与CS的铵基相连,CS-NP中的分子间和分子内作用得到改善。的光谱 bi蛇 比较了载有毒液的CS-TPP纳米颗粒和毒液,在1455 cm处显示了相同的峰–1 and 1541 cm–1,因此我们得出结论,毒蛇的结构在加载期间仍保持完整[27,28]。

CS浓度的影响

应用了粒度分析仪来评估不同CS浓度(2、2.5, &3 mg / mL)。结果表明,CS浓度从2 mg / ml增加到3 mg / mL,而TPP浓度(1 mg / mL)是恒定的,导致纳米颗粒尺寸增加(表1)。由于形成大直径的聚集体,CS浓度为2 mg / ml和3 mg / mL的纳米颗粒的PDI值不在可接受的范围内。纳米粒子的PDI值在CS浓度为2.5 mg / mL时是理想的。结果还揭示了CS / TPP质量比对EE和蛋白质释放曲线的影响。因此可以得出结论,较低的CS / TPP比值导致较高的蛋白质包封率[32]。当CS浓度较低时,液相的抗分散性降低,导致形成较小尺寸的纳米颗粒并增加毒液封装[33,34]。 CS的分子量通常是确定最佳CS / TPP质量比的重要因素[32,35]。考虑到本研究的结果以及先前关于最佳包囊和整体释放的研究结果,可以认为使用2.5 mg / mL的CS浓度和1 mg / mL的TPP浓度可以很好地支持毒液负载。

毒液浓度对LC和EE的影响

毒液浓度的影响(20、50、100、200、300、400、500、750和1000 μ在这项研究中检查了EE和LC上的g / mL)。结果表明毒液浓度从20增加 μg/mL to 750 μg / mL导致EE升高,尽管其高于750的毒液浓度保持不变 μg / mL,(图3)。结果还表明浓度高于50 μg / mL毒液是造成毒液负载的重要因素[28]。如图4所示,纳米颗粒’在更高的毒液浓度下,载药量甚至提高了100%以上(400 μg/mL to 1000 μg / mL)。先前有关蛋白质浓度对封装作用的报道并不全面,有时是矛盾的。但是,这项研究与某些研究人员的研究一致。这项研究的结果与Xu和Du [36]获得的结果不一致,Xu和Du [36]报告了在pH 6.0时对牛血清白蛋白(BSA)包封的反向结果。 Jarudilokkul S等。也报告了相同的结果α-乳清蛋白,细胞色素C和核糖核酸酶A [37]。作为一种交联剂,TPP可以与蛋白质和CS分子上的游离胺基反应,从而开发出更紧密的蛋白质CS-NP。蛋白质在纳米粒子表面的数量和大小因蛋白质在纳米粒子表面的过度吸附而增加[37]。在这方面,建议是毒液浓度高于400 μg / mL不适合该应用,因为它们可能导致毒液在纳米颗粒表面上的额外吸附,进而导致zeta电位降低和颗粒聚集[28]。

抗蛇毒产品是从马超免疫血清中提取的,能够中和伊朗六种最常见蛇的毒药,其中包括5种毒蛇(棘皮car鱼,Vi蛇le 、,蛇,Ag蛇,  假瓷膏)和一种稀有物种(眼镜蛇)[38]。该产品已被专业用于治疗蛇咬伤。

我们小组先前曾报道过载有多种抗原的CS-NP,例如 眼镜蛇 [39], 优胜美生but(Mesobuthus eupeus)[28], mis [40], Echis Carinatus [27]和 破伤风类毒素 (发布时)。对于 眼镜蛇(Naja-Naja Oxiana), 最佳LC和 EE浓度为400的毒液 μ对于LMW CS,浓度为2 mg / mL时,得到的g / mL和TPP浓度为1 mg / mL。关于 中叶虎耳草’ 最佳的封装和负载能力,建议将2 mg / mL的CS和1 mg / mL的TPP用于400µg / mL毒液负荷量(LMW CS)。此外, 当CS浓度(低MW CS)和 mis 毒液为2 mg / mL和400 μg / mL。但是在我们的研究中,我们将CS与MMW一起使用。相比之下,Mohammadpour等人针对Naja-Naja Oxiana,Mesobuthus eupeus和mis毒液的报道,具有CS的MMW的Vipera albicornuta毒液具有LMW的CS负载能力可以增加,但是我们可以降低毒液的浓度(表2 )。此外,表2还显示了MMW-CS-NP的EE大于LMW-CS的EE。这可能是由MMW CS的较长链引起的,当与TPP凝胶化时,MMW CS会产生更多的毒液。

体外释放

这项研究的结果表明,在PBS中孵育的前36个小时内,释放了约40%的毒液。从NP中释放出的毒液显示出在孵育的最初几个小时内爆发性释放,随后缓慢释放40小时(图5)。观察到的爆发是由于蛋白质分子的分解引起的,这些蛋白质分子松散地结合到CS-NP的表面并从纳米颗粒的表面释放出来。 [11,41]。关于释放曲线的第二部分,被包裹的蛋白质分子以近似恒定的速率缓慢释放是由纳米颗粒的缓慢分解引起的。 36小时后,蛋白质降解速度先于释放速度[42]。

结论

在这项研究中,CS-NP载有 bi蛇 通过TPP作为交联剂,通过最近优化的离子凝胶法制备了蛇毒,以检查纳米粒子的理化性质。在这项研究中使用了MMW壳聚糖。 CS,毒液和TPP的最佳浓度分别为2.5 mg / mL,400 μg / mL和1 mg / mL;最佳CS / TPP比为5:2。在上述条件下,制备了载有毒液的纳米颗粒,其尺寸为187 nm,LC为86%,EE为94%和可接受的PDI。此外,发现控释特性可能受不同因素的影响,例如CS和毒液浓度。因此,本研究中制备的CS-NP似乎是常规递送系统的替代品。

致谢

研究人员在此感谢拉齐疫苗和血清研究所(RVSRI)的实验室工作人员和图书馆工作人员的协助。

利益冲突

研究人员报告没有利益冲突,并且对文章的内容和撰写负责。

 

 
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