外泌体紫杉醇:两种胶质母细胞瘤细胞系的制备和毒性评估

文件类型:原始研究文章

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1 克尔曼医科大学神经药理研究所药物研究中心,伊朗克尔曼

2 克尔曼医科大学药学院药剂学系,伊朗克尔曼

3 克尔曼医科大学神经药理研究所神经科学研究中心,伊朗克尔曼

4 克尔曼医科大学药学院药物化学系,伊朗克尔曼

5 克尔曼医科大学药学院药物生物技术系,伊朗克尔曼

抽象

目标:外来体是内源性纳米囊泡,可作为细胞间通讯工具,被认为可以用作药物递送系统。由于将治疗分子转运到大脑中会遇到障碍,因此准备有潜力穿过其障碍的外来体是一项巨大的挑战。

方法:从U87胶质母细胞瘤细胞的细胞培养基中分离出外泌体。在下一步中,将紫杉醇(PTX)装入其中以研究该制剂对成胶质细胞瘤U87和T98G两种细胞系的细胞毒性。还评估了药物表征,如大小分析,PTX包封效率和外泌体的FESEM / TEM成像。

结果:在提取的样品中检测到CD9作为外泌体的生物标志物,以确认外泌体的存在。大小分析和电子显微镜成像证明分离和载有药物的外泌体的纳米范围。 U87细胞的空外泌体对U87和T98细胞的细胞毒性有所不同。与对照组相比,外泌体降低了U87细胞的细胞活力,而在T98细胞系中,它们没有’在间隔24或48小时后对细胞活力没有任何影响。载药外泌体的细胞毒性在两个时间间隔是不同的,在两个时间间隔内,载药PTX的外泌体分别在24和48小时后对T98细胞无影响或细胞活力降低30%。

结论:包裹入外泌体后PTX的细胞毒性增加,并且外泌体的BBB转运能力有望为GBM动物模型的体内表征提供合适的脑药物递送系统。

关键词


介绍

外泌体是细胞递送的纳米囊泡,可在细胞之间进行通讯。它们包含一些材料,如RNA和蛋白质,可在细胞间调节信息。外泌体是细胞外囊泡(EVs)的一个分支,包括凋亡小体(500-1000 nm),微囊泡(100-500 nm)和大小范围较小(40-100 nm)的外泌体[1]。这些细胞衍生的囊泡在其膜上具有特定蛋白,例如四跨膜蛋白(CD9,CD63,CD81),Alix和膜联蛋白,以及一些核酸化合物,例如肿瘤敏感基因101(tsg 101),用作外来体检测的特异性标记物[2, 3]。由于外泌体起源于细胞膜,它们由独特的组织/细胞类型特异性蛋白质和结构组成,这些蛋白质和结构存在于它们的亲代细胞中[4]。外泌体的这种特性鼓励研究人员将这些纳米囊泡用作诊断疾病的生物标记。研究了尿液样本中的外来体对前列腺癌[5]卵巢[6]和肺[7]和肾病[8]的诊断,以及其他针对阿尔茨海默氏症的生物样本的诊断’s疾病[9],癌症(和其他疾病[10]。

由于细胞之间的纳米范围和信使作用,可以转移不同的货物,因此外来体可以用作药物输送系统。因此,将治疗剂掺入外泌体可避免快速清除被包裹或吸附的活性药物成分(API)。另一方面,与细胞介导的和合成的纳米药物递送系统相比,外泌体的毒性较小[11]。同时,外来体以特定的细胞向性反映其细胞来源的膜结构,并可用于靶向治疗其亲代细胞或其他细胞。

外来体已被用于有效递送姜黄素[12]作为抗炎药,紫杉醇(PTX)作为一种有丝分裂抑制剂[13,14]作为水溶性差的抗新肿瘤化合物。在药物输送方案中,由于血脑屏障对API的运输有抵抗力,因此将治疗成分转移到大脑存在特殊挑战[15,16]。在某些情况下,例如多形性胶质母细胞瘤(GBM),有效的癌症化疗化合物,例如用于GBM的PTX可以封装在外泌体中[17]。 PTX的水溶性低(logp 3)和i.v.这种药物的管理需要利用胶束(TaxolTM值 )或纳米共轭物(AbrexaneTM值 )系统,可在药品市场上购买。

已经引入了多种用于外泌体分离的方法[18,19],包括差速超速离心和密度梯度离心[20,21],聚合物沉淀[22,23],基于抗体(Ab)附着的免疫亲和法[24],尺寸排阻色谱法[25]和微流体系统[26,27]。这些方法因其操作步骤和所得外泌体的纯度而异,存在一些优缺点[28-30]。在这项研究中,我们通过Exocib分离了外泌体® 基于先前提到的沉淀方法的试剂盒[17]。

在本研究中,将PTX装在外泌体中,以增加溶解度并增加其对两种GBM细胞类型(U87 MG和T98 G)的作用。还研究了PTX外泌体的药物表征,包括尺寸分析,微观研究(TEM和FESEM)和包封效率。

材料和方法

杜尔贝科’s modified Eagle’从GIBCO(Invitrogen Inc. Gibco BRL,美国)购买培养基(DMEM)和耗尽外来体的胎牛血清(FBS)。青霉素加链霉素溶液和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)获自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。 Exocib外泌体分离试剂盒由Cibbiotech Co.(伊朗德黑兰)提供,CD9 TRIFicTM外泌体测定(EX101)均从Cell Guidance Systems(英国剑桥)获得。双辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒由Santa Cruz Biotechnology(美国得克萨斯州)提供。 PTX购自Sobhan-Oncology制药公司(伊朗,拉什特)。其他溶剂和试剂均为分析纯,购自默克公司(德国达姆施塔特)。

细胞培养

人脑神经胶质母细胞瘤-星形细胞瘤U87 MG和T98 G细胞(Pasture Institute,伊朗德黑兰)培养于75厘米2 高葡萄糖DMEM中放入烧瓶(Iwaki,Tokyo,Japan)。培养物补充有10%FBS,1%青霉素和链霉素,并保持在5%CO的潮湿气氛中2 at 37 ± 0.5 °C.当细胞培养达到80%融合时,仅从U87细胞中提取外来体。

外泌体隔离

使用Exocib分离试剂盒(包含试剂A和B)从U87cells培养基中分离外泌体。根据制造商的协议,为去除细胞碎片,新鲜收集细胞培养基,并由海蒂诗(Hettich)以3000 rpm离心10分钟。 ®Universal ٣٢٠R离心机(德国图特林根)。然后将得到的上清液分别与Exocib试剂盒中的试剂A分别以5:1的比例混合,然后将混合物涡旋5分钟,充分混合,并在4℃下过夜°C.接下来,将混合物以3000 rpm的速度离心40分钟,弃去上清液,并将外泌体板重悬于100µl试剂B。最终,产品保存在-80°C用于下一阶段的研究。

药物进入外泌体

通过温育方法将药物掺入外泌体中,该方法常用于外泌体的装载[31,32]。因此,在DMSO中制备了PTX储备液(50 mg / ml),然后稀释至40 µ含DMSO和PBS(pH 6.8)的微克/毫升。分离的沉淀中含有从上一节最后一步获得的外来体,重悬于100 µPBS溶液中的PTX溶液1升,在37℃孵育± 0.5 °C for 1 h.

外泌体表征

评价了这些提取的纳米颗粒的尺寸,ζ电势和电子显微镜图像。外泌体的大小分析是通过光子相关光谱法(PCS; Cordouan,VASCO纳米颗粒大小分析仪,Pessac-Bordeaux,法国)进行的。场发射扫描电子显微镜(FESEM;日立S-4160,日本东京)和透射电子显微镜(TEM; Philips,德国)用于进一步分析尺寸和形态。为了制备用于FESEM成像的样品,将外泌体悬浮液在室温下干燥并涂覆金薄层,然后通过使用20keV的加速电压进行检查。同样对于TEM成像,在通过在碳涂覆的铜栅(200目)上干燥制备外泌体样品之后,使用80keV的加速器电压。使用WALLIS Zeta电势分析仪(法国Pessac-Bordeaux)测量引入了外泌体表面电荷的外泌体Zeta电位。

外泌体蛋白质测定

应当确定外泌体的总蛋白质含量,以量化分离出的外泌体的数量并评估药物载量。通过包含标准溶液,铜试剂和BCA试剂的BCA蛋白测定试剂盒进行了测​​定。绘制了不同浓度范围(50-250µ克/毫升)牛血清白蛋白作为标准溶液。铜试剂和BCA的比例应分别为1:50。外泌体制备的样品和标准溶液与两种试剂混合并在60°C下孵育°C持续15分钟。然后,使用NanoDrop在562 nm处的相关吸光度TM值  记录分光光度计(ND-1000,Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE,美国)。

通过TRIFic检测外泌体CD9标记TM值  kit

要测量外泌体的表面蛋白,CD9 TRIFicTM值  根据制造方案使用外泌体测定试剂盒(基于(时间分辨的免疫荧光检测外泌体抗原)。该试剂盒由链霉亲和素包被的96孔板组成,应将这些孔用新鲜制备的生物素化CD9单克隆抗体稀释溶液包被,以将CD9捕获在外泌体表面。在该程序之后,将样品添加至孔中,并与摇动孔一起温育,以便通过Ab捕获CD9抗原。之后,将labeled标记的CD9 Ab稀释液添加至孔中,以特异性结合外泌体抗原,以通过荧光读取器进行检测。激发和发射波长分别为340和615 nm,并通过多模式酶标仪(Synergy 2,BioTek,Winooski,VT,美国)进行测定。在板式振荡器中以750 rpm进行每个步骤的孵育,并且在每个步骤之间,用洗涤缓冲液将孔洗涤3次。通过使用LNCaP冻干外泌体通过其方案制备阳性对照。

RP-HPLC测定外泌体中PTX的含量

设计并测试了几种HPLC规程,以找到最佳分离度,保留因子(k),不对称因子(As),理论塔板数(N)和色谱峰的塔板高度(H)。表1列出了用于分析PTX的最佳方案。

外泌体制剂对U87和T98细胞系的细胞毒性

GBM的两个细胞系(U87和T98)用于评估PTX溶液,空外泌体和载有PTX的外泌体制剂的细胞毒性。为了进行MTT测试,将细胞接种到平底96孔组织培养微孔板中,并孵育24小时(37°C, 5 % CO2 加湿的空气)坚持。一式三份将制剂加入所需的孔中,然后在24和48小时测定细胞的存活。然后随着时间的推移孵化100 µ将1μl的MTT溶液(在培养基中为1mg / ml)加入到每个孔中并温育2小时。形成的甲maz晶体应溶于100 µ通过ELISA板读数器(Synergy 2,Biotek,Winooski,Vermont,USA)在1nm的DMSO中在570nm处测量其吸光度。对于每组,将3块板视为对照组,以确定与它们相比的细胞活力百分比。

统计分析

所有数据均以均值形式表示±标准偏差(SD)。使用SPSS 21(IBM)通过Post Hoc检验通过单向方差分析(ANOVA)比较数据;统计差异显着性定义为 p < 0.05.

结果与讨论

外泌体的药物表征

由于外来体的特定条件(例如纳米大小),并且在其表面上含有亲本细胞衍生的标记物,因此已广泛用于诊断和治疗目的。外泌体是细胞之间的内源性载体,在各种体液中都可以发现它们,例如血液[33],尿液[34],牛奶[32],唾液[35]和其他生理液[36],也可以将它们分离出来来自细胞培养基。

在这项研究中,外泌体是从U87cell系中提取的,并装有PTX。尽管外泌体的大小可能会因来源和制备方法或储存条件的不同而有所不同[29、37、38],但它们的大小应在40-100 nm左右,如各种神经母细胞瘤细胞的脂质囊泡所描绘的[39]或其他细胞系[40]。 na的平均流体动力学直径ïve和载药的外泌体分别为70.69 nm和89.04 nm,如表2所示。因此,在掺入PTX后观察到外泌体大小显着增加(<0.05)。由于API的表面吸附或结构成分的重排,治疗成分的装载量可能会影响双层脂质囊泡(如脂质体[41]和外泌体[11])的粒径。奥沙利铂和伊立替康在纳米脂质体中的单次装载或共同装载也导致了不同的大小范围[42]。另一方面,TEM和FESEM图像显示,从U87细胞培养基中提取的外泌体的大小范围为50-150 nm(图1和2)。通过图像技术(TEM / FESEM)和PCS或动态激光散射(DLS)方法获得的外泌体平均直径的差异是由于PCS中的颗粒扩散双层计算以及非等向性测量中DLS技术的准确性不足颗粒[43]。

可以通过分析纳米粒子的ζ电位来评估它们的聚集特性,并且由Kato等人发现外泌体的ζ电位与其细胞来源之间的相关性。 [44]。尽管从各种细胞系中分离出的外泌体报告了Zeta电位差异很大[45],但已发现(表2),这些提取的外泌体的Zeta电位接近高胶体分散热力学稳定性所需的关键Zeta电位[46,47]。 。

因此,将外来体​​中的PTX负载报告为负载能力。为了计算负载能力,通过HPLC分析确定负载在外泌体上的PTX的量,并通过BCA方法评估外泌体的总蛋白质含量。将载于U87的外来体中的PTX划分为总蛋白的结果为0.74 ng / mg。与其他脂质囊泡相比,提取的外泌体的负载能力非常低,例如侵入蛋白功能化的纳米脂质体[48],这可能是基于蛋白质含量而非脂质含量的计算得出的。

外泌体的生物学表征

建议在几种外泌体提取方案中,与 超速离心和密度梯度程序[49]。此外,在通过使用过的聚合物的辅助的沉淀技术中,与超速离心法相比,需要通过较慢的离心速度来缩短时间。我们还使用了与我们最近的研究[17]中所示的方法相同的方法。

为了确认排泄出的纳米颗粒实际上是外泌体的大小范围,应在其表面或生物学样品上找到特定的生物标记物,例如CD9,CD63,CD81。这样,CD9 TRIFicTM值  与Kamińska等类似,使用了基于单克隆Ab-CD9抗原亲和力的外泌体检测试剂盒。 [50]。在两个纳米粒子中都检测到了这些纳米粒子上CD9的存在ïve和载有药物的囊泡,是由于使用了相似的分离细胞系方案。四跨膜蛋白CD9与金属蛋白酶CD10相互作用,并通过外泌体增加其释放,如Mazurov等所述。研究[51];他们认为CD10活性从质膜到外泌体的重新分布在调节细胞外微环境和B淋巴细胞的成熟中起着重要作用。

制剂的细胞毒性

负载PTX的细胞毒性和NAï在24和48小时时,在GBM的两个不同细胞系U87和T98中评估了Ve外泌体以及PTX溶液(在载药外泌体中浓度相似)。在类似的PLGA纳米颗粒制剂研究中,选择U87细胞系来研究细胞毒性作用。[52]。图3和图4的结果表明,PTX对T98细胞的细胞毒性作用大于U87细胞,后者对T98细胞的作用在48小时后增强,但PTX却没有。’与48小时持续时间相比,在24小时后对U87细胞有显着影响(p ˃ 0.05)。这可能与U87细胞的48小时复制时间有关[53]。从U87细胞中提取的外泌体对作为其亲本细胞的U87细胞具有毒性作用,但是这些制剂并没有’对T98细胞系有任何毒性作用。 Yang T.所做的一项研究[31]显示,从U87细胞系分离的外泌体降低了U87细胞的生存能力。在外泌体配制过程中,PTX对U87细胞的细胞毒性在24和48 h均增加,而在T98细胞上,PTX的外体配制不能增加PTX毒性。

结论

简而言之,由于外来体是内源性纳米囊泡,因此被认为可用于治疗方面。在这里,从U87细胞系中提取外来体,并在其中装载PTX。外泌体对两种细胞系的细胞毒性是不同的,这可能是它们被分离出的外泌体起源的原因。但是,还需要更多的研究来明确讨论外泌体的细胞毒性作用。

致谢

这项工作得到了伊朗克尔曼的克尔曼医科大学的资助(批准号95000430)。我们还要感谢克尔曼医科大学的中央研究实验室在研究中的出色贡献。

利益冲突

作者声明,有关此手稿的出版没有利益冲突。

 

 
35. Zlotogorski-Hurvitz A,Dayan D,Chaushu G,Korvala J,Salo T,Sormunen R,VeredM。人唾液来源的外泌体:比较分离方法。组织化学杂志& Cytochemistry, 2015;63 (3):181-189.
53. Arzani H,Adabi M,Mosafer J,Dorkoosh F,Khosravani M,Maleki H,Nekounam H,KamaliM。载有姜黄素的PLGA纳米颗粒的制备及其对人胶质母细胞瘤U87MG细胞的细胞毒性作用的研究。应用化学中的生物界面研究, 2019.