透明壳聚糖/明胶/蜂蜜/芦荟纳米复合材料的制备及生物医学性能

文件类型:原始研究文章

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伊朗马勒阿什塔尔科技大学化学与化学工程学院

抽象

目标:可生物降解的聚合物在生物技术和生物工程方面具有显着的潜力。但是,它们的适用性仍然存在局限性,因此在许多情况下都使用复合形式。本研究的重点是用于制备薄膜的壳聚糖(CS),明胶(GEL),蜂蜜(H)和芦荟(AV)。
方法:使用8%的CS和GEL制备薄膜。同样,以20:20:2的比例制备AV,蜂蜜和小麦胚芽油(WGO)。之后,将溶液倒入培养皿中。将培养皿在室温下保存24小时,直到形成膜为止。然后,分别在CS / GEL / H,CS / GEL / AV,CS / GEL / H / AV薄膜上进行CS / PEO / H,CS / PEO / AV,CS / PEO / H / AV纳米纤维的静电纺丝。
结果:检查了抗菌活性,成纤维细胞培养和溶血活性的结果。抗菌测试结果表明,含有蜂蜜的薄膜对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有抗菌活性。制备的样品上成纤维细胞的结果表明超过90%的细胞是活的。也,
溶血活性结果表明样品是非溶血的。
结论:考虑到薄膜的整体理化和生物学特性,它们可以有利地用作有前途的抗菌涂层生物材料。

关键词


介绍

伤口愈合是一个自主过程,可能会在慢性伤口或烧伤中中断。可生物降解的聚合物在生物医学和生物工程方面有许多用途,例如伤口敷料和癌症治疗[1]。但是,它们的适用性仍然存在局限性,因此在许多情况下都使用复合形式。因此,寻找能够提供覆盖面并在防止感染的同时加快愈合过程的敷料是当务之急[2]。合适的敷料必须具有的最重要特征是:在罐壁表面保持足够的湿度,有效成分的转移,防止微生物生物膜的形成,减轻疼痛和膨胀,清创性死皮和损害组织以及促进细胞之间的反应以及对伤口调节和愈合有效的蛋白质[3,4]。由于没有已知的材料可以拥有所有这些规格,因此使用生物聚合物的组合来改善伤口愈合过程。 Sasikala等。提出用CS水凝胶膜和蜂蜜作为伤口敷料[5]。 Wang等。以20:20:0.5的比例制备了GEL,蜂蜜和CS的水凝胶,在抗菌和毒性试验中获得了最佳结果。此外,该混合物对伤口的收缩和加速愈合过程也有重要作用[6]。 Isfandiary等。使用CS / collagen / AV,作为具有高细胞增殖性能的烧伤的合适覆盖组合[7]。 Illani等。用CS和AV凝胶制备纳米​​纤维[8]。

低分子量和平均分子量的CS分别用于生产薄膜和纳米纤维。 CS是具有伤口愈合作用的生物相容性,可生物降解的天然聚合物[9]。用于制备这些抗菌涂层的最合适的生物聚合物之一是CS。 CS的独特规格之一是它能够加速肉芽组织的形成以及血管生成和精细胶原组织的有序沉积,从而导致伤口完全愈合。 CS的生化作用是激活细胞因子产生剂的成纤维细胞并触发V型胶原的合成[10]。此外,CS / GEL膜是CS /聚环氧乙烷(PEO)纳米纤维的基础,并改善了其许多特性。由于Arg-Gly-Asp(RGD)序列,CS的生物学功能例如当与明胶合用时,粘附性,细胞迁移得到改善。此外,GEL的亲水特性可确保伤口保持湿润,并为伤口提供营养和氧气[11]。

另一方面,百里香蜂蜜和AV等草药溶液已用于加速伤口愈合。已经对蜂蜜的抗菌活性进行了一些研究,并且已经确认了抗菌活性。因此,蜂蜜具有高渗透压,低pH(3.5-5)和产生过氧化氢的能力,因此被认为是伤口愈合和抗菌作用的因素[12-14]。由于化合物的种类繁多(例如氨基酸,抗激肽(aloin),发色团(aloesine),酶,激素,类固醇,矿物质,维生素),AV具有多种药物特性[15,16]。 AV凝胶的主要作用之一是保持伤口湿润,并由于水分含量高而促进上皮细胞迁移。 AV多糖可改善成纤维细胞的迁移,透明质酸和羟脯氨酸的生成以及成纤维细胞中硫酸皮肤素的水平,这在重建细胞外部基质结构中起关键作用 [15、17、18]。

这项工作的目的是提供一种抗菌涂层,并随后防止生物膜的形成。 因此,目前的研究集中在CS,GEL,H和AV制备薄膜上。

实验性

用料

中低分子量CS和脱乙酰度为75-80%的CS,GEL,PEO分子量为900.000 g.mol-1,玻璃化温度(Tg)为57°C和۶۳-۶۸的熔点°C, viscosity: 400–800 CP从Sigma Aldrich(美国)购买。冰醋酸纯度96%,分子量60.05 g.mol-1,两次蒸馏和去离子水,吐温80和营养琼脂 购自默克公司(德国达姆施塔特)。 百里香蜂蜜,AV凝胶和WGO分别购自Misivan,Parsiteb和Talayetabiat公司(伊朗)。 金黄色葡萄球菌 (金黄色葡萄球菌)株(ATCC 29213)和 铜绿假单胞菌 (铜绿假单胞菌)株(ATCC 29213)。

薄膜的制备

为了制备薄膜,使用了低分子量,浓度为1%(w / v)的壳聚糖和比例为8%的明胶。将溶液容器安装在加热搅拌器上,并在溶解壳聚糖的同时添加1ml乙酸。同样,AV,蜂蜜和WGO的比例为20:20:2。然后,将吐温80(0.25ml)作为乳化剂加入到溶液中。用封口膜密封烧杯(以避免蒸发并提高溶液密度)。将获得的溶液储存5-4h,直到聚合物完全溶解到溶液中为止。为了去除气泡,将溶液离心20 分钟(4000rcf)。之后,加入0.2ml乙二醇作为增塑剂,并将7ml溶液倒入培养皿(7mm)中。将培养皿在室温下保存24小时,直到溶液蒸发形成膜为止。

ATR-FTIR光谱

功能组及其之间的相互作用 薄膜的成分通过 ATR-FTIR(Perkin Elmer,Spectrum GX)。

抗菌活性评估

使用琼脂平板法,革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和革兰氏阳性菌研究抗菌活性 金黄色葡萄球菌.

首先,按照供应商提出的方案制备营养琼脂微生物培养物。两种革兰氏阴性菌的悬浮液 铜绿假单胞菌 和革兰氏阳性细菌 金黄色葡萄球菌 (1.5×108 制备)。制备培养物并使用经悬浮液灭菌的棉签后,在含有营养琼脂培养物的平板表面上进行均匀培养。

为了调查制备薄膜的抗菌活性,将样品切成1片。×1厘米,并使用生物罩的紫外线辐射灭菌。然后将样品放在平板表面上并将平板放置在培养箱中(37°C)24小时。之后,测量样品周围的生长抑制晕环的直径。

制备静电纺丝用高分子溶液

制备聚合物溶液

CS溶液是使用50%(w / v)的酸性醋酸溶剂制成的。首先,将0.2g平均分子量的壳聚糖粉末搅拌到溶剂中。将该溶液在环境温度下保持12小时,直到壳聚糖完全溶解。然后将PEO(0.3g)溶解在酸性乙酸/水溶液(10ml)中以获得3%(w / v)的PEO。

在单独的容器中制备2%(w / v)的CS溶液和3%(w / v)的PEO在50%(w / v)的酸性乙酸/水中时,将它们以30:70的比例混合,然后吐温80(0.25) %)用作乳化剂。然后,添加蜂蜜和AV的比例为1%(w / v)作为添加剂,并使用对位膜密封烧杯(以防止蒸发并增加溶液的密度)。之后,将溶液置于37 rpm的高转速加热器中°保持24小时,直到所有聚合物含量溶解。

静电纺丝工艺

用于制备纳米纤维的电纺丝装置 (纳米轴)。将每种聚合物溶液倒入内径为10mm的塑料注射器(5ml)中,该注射器用直径18G(喷嘴)的针头和平头连接。喷嘴与聚集板之间的感应电压为20-22kv,放电速度为0.1-0.5ml / h,喷嘴尖端与聚集板之间的间隙为13-15cm。值得注意的是,分别在CS / GEL / H,CS / GEL / AV,CS / GEL / H / AV薄膜上完成了CS / PEO / H,CS / PEO / AV,CS / PEO / H / AV纳米纤维的静电纺丝。

纳米纤维的形态表征的确定

纳米纤维的形态使用扫描电子显微镜(SEM)在20.0 kv(蔡司- SIGMA,VP-500)镀金后。

成纤维细胞培养

人类皮肤成纤维细胞(HDF)用于细胞培养。在这项研究中,具有CS / PEO / H / AV纳米纤维而没有纳米纤维的CS / GEL / H / AV薄膜由于其适当的特性而被用于体外细胞培养测试。将具有和不具有纳米纤维的薄膜连接到六格板的底部。制备成纤维细胞第四代的细胞悬浮液,并通过台盼蓝染料以体积为单位记录基于活细胞和死细胞的细胞计数后,将5000个细胞添加到每个平板中。然后将板放入培养箱(CO2 5%;37°C)并检查活细胞的生长水平和增殖,通过倒置显微镜(Leica-Germany)监控每个部分,并使用安装在显微镜上的数码相机(Infinity1)拍照。为了计数细胞,随机选择五个放大倍数为100X的显微镜视野,并对视野中的细胞数进行计数。该过程进行了三次,每次选择四个隔室。

溶血试验

溶血的 研究了有/无CS / PEO / H / AV纳米纤维时CS / GEL / H / AV薄膜的活性。有两种方法用于溶血测试:

第一种方法:使用血琼脂培养基研究溶血 有和没有纳米纤维的薄膜的活性 on red blood 细胞。首先,样品被切割(1×1cm) 和 sterilized under UV light. The samples 是 then placed on the 血液 agar medium 板块. All the 板块 were 在37孵育°C持续48小时。然后裂解区的直径为 measured.

第二种方法:为了评估溶血百分比,将健康人的血液样本倒入柠檬酸钠的抗凝管中以防止血液凝结。然后用0.9%的氯化钠稀释比例为1:1.25的血液。薄膜样品(1 × 1厘米)放入猎鹰管,并向样品中加入0.2毫升肝素化的人血。然后使用0.9%的氯化钠将样品体积增加至10 ml。样品以2500 rpm离心10 分钟之后,吸光度 of the samples 是 measured at 545 nm. 对于阴性和阳性对照,使用0.9%的氯化钠和去离子水。溶血率计算如下:

心率=(Dt – D数控 )/(D个人电脑 – D数控 ) × 100% (1)

D在哪里t,D数控  and D个人电脑 分别是样品,阴性对照和阳性对照的吸光度[19]。

结果与讨论

薄膜的制备

表1列出了薄膜数据。 CS / GEL的组合用于制备膜。所获得的膜是透明且均匀的,并且与水接触时会起皱并破碎成碎片。拉伸强度和稳定性也不能令人满意(图1)。为了解决与水接触时的起皱问题,使用了低百分比的WGO(%2 v / v)来形成水听器在现场的覆盖范围。由于水中油的模拟性质,薄膜不再均匀。为了提高膜的均匀性,在离心步骤之前添加油。无论如何,拉伸参数都不令人满意,并且薄膜非常易碎(图2)。

图3(A)示出了具有蜂蜜(5、10、20%(w / v))的CS / GEL薄膜。通过添加蜂蜜,不仅在薄膜中增加了新的特性(如更大的柔韧性),而且还提高了拉伸强度。另一方面,改善了薄膜的许多生物学特性,如抗菌效果。通过上述比例,未观察到抗菌作用。另外,向薄膜中添加5%或10%(w / v)的蜂蜜可以改善其柔韧性和拉伸强度。蜂蜜浓度增加到20%(w / v),改善了其抗菌特性。然而,更高含量的蜂蜜会增加膜的粘合性,并且膜的稳定性不是优选的。为了解决这个问题,改变了组合比例,并获得了最佳的特性,其中GEL 8%(w / v),CS 1%(w / v),H 20%(w / v),AV 20%和WGO 2 %(w / v)(表2)。

图3(B)是CS / GEL / H,CS / GEL / AV,CS / GEL / H / AV薄膜的宏观图像。这三张膜的表面柔软,透明,光滑且均匀。但是,含蜂蜜的样品与其他样品相比略带黄色。

ATR-FTIR分析

ATR-FTIR是说明分子水平化学变化的最佳工具。峰的宽度,强度和位置对化学变化和大分子构象敏感。

使用AR-FTIR在400-4000cm处确定薄膜中的官能团-1 范围。图4显示了CS / GEL,CS / GEL / H,CS / GEL / AV和CS / GEL / H / AV膜的ATR-FTIR光谱结果。

在CS / GEL膜中,在1080cm处有很强的吸收带-1 代表壳聚糖的C-0拉伸振动。另外,吸收带在1336cm-1 代表明胶和壳聚糖的N-H键。

1629厘米处的强吸收带-1 and 1540cm-1 分别代表酰胺I和酰胺II的峰。所得的C-H拉伸振动在甲基中的吸收带出现在2929 cm-1.

宽阔的吸收带(3292厘米)-1 代表壳聚糖和明胶的O-H和N-H基团的拉伸振动;通常,胺I在3200cm附近显示吸收带-1 and 3500cm-1 这些带分别是自由的N和H拉伸振动。较宽的带是由于明胶和壳聚糖之间的氢键。

CS / GEL / AV的ATR-FTIR光谱图在3289cm处显示出很强的宽带-1 该峰是由于CS,GEL和AV组的O-H组的拉伸振动所致。此外,该区域包含与O-H基团重叠的N-H基团的拉伸振动的峰。 WGO含有高含量的亚油酸,在同一区域具有很强的吸收峰。

此外,该图还显示了1635厘米处的强吸收带-1 区域,可能是由于在COOH,-NH之间形成了酯键或酰胺键2,或-OH AV,CS和GEL组。在该区域,CS具有胺基和C = O的拉伸振动的峰值。

吸水带1558.58cm-1 区域是由于C = C键的拉伸振动所致,这表明芦荟和乙烯基醚。另外,表示AV存在的芳香环。

吸收带在1240厘米-1 代表酯和酚的C-O基团的拉伸振动。另外,在1084cm处的吸收带-1 代表AV的C-0多糖的拉伸振动。

在CS / GEL / H膜的ATR-FTIR光谱中,CH的C-H对称和不对称拉伸振动的吸收带2 小组出现在2929厘米-1 表示吡喃糖环的区域。该带也表明化合物中存在脂肪族基团。另外,该峰表示NH的拉伸振动3+ 游离氨基酸和羧酸的C-H。在该区域峰的增加表明由于化合物的官能团,蜂蜜化合物与CS / GEL膜之间具有适当的键合–OH 和 –NH2.

在1027厘米处观察到的峰值-1 表示C-O和C-C在碳水化合物结构中的拉伸振动。

一般而言,与CS / GEL / AV的ATR-FTIR光谱相比,吸收带在919cm-1, 1247厘米-1和1339厘米-1 确认复合物中存在蜂蜜。

如图5所示,CS / GEL / H / AV复合膜的ATR-FTIR光谱与CS / GEL / H膜的光谱没有明显不同。这表明AV对CS,GEL和蜂蜜之间的相互作用不是很有效。原因之一可能是在准备的最后阶段添加了AV。另一个值得注意的点是,与AV相比,蜂蜜与CS和GEL有很强的相互作用。在这里,吸收带为1250厘米-1 代表AV和吸收带1558 cm的C-O酚基的振动-1 表示AV中乙烯基醚化合物的C = C键的拉伸振动。与CS / GEL / AV薄膜的光谱相比,每个波段具有三个单位的位移。

抗菌活性评估

微生物测试包括测量薄膜周围生长抑制晕圈的大小以及不同样品中使用的添加剂。生长抑制晕圈的大小指示抗菌活性的程度,该程度是对抗菌活性有效的试剂的功能及其在琼脂培养基中的释放速率。

检查了蜂蜜和AV对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗菌活性。蜂蜜产生了直径为30和28mm的生长抑制晕圈 金黄色葡萄球菌 and 铜绿假单胞菌 分别。 AV凝胶没有显示出抗菌活性(图5)。

还检查了CS / GEL膜的抗菌活性。该膜未显示抗菌活性(图6(A,D)),其原因之一是在琼脂培养基中膜的有限释放。 Pereda等。结果表明,如果不迁移活性剂,则不会触发CS的抗菌活性。当CS处于固态时,只有与活性部位接触的生物才能被抑制。因此,固态形式的CS不能在琼脂培养基中释放,这意味着较低的抗菌活性[20]。而且,由于其羧基作用,GEL在与CS的胺基反应后失去了抗菌作用。洛佩兹等。对CS粉末对革兰氏阴性细菌生长的抗菌活性进行了调查,发现将CS粉末添加到细菌培养物中对它们的生长无效。这可以通过CS在生理pH值中的低溶解度和非活性胺基的存在来解释[21]。 Saiz等。表明CS膜不是抗菌剂。 金黄色葡萄球菌 而且这种效果只能在凝胶或溶解状态下发现,其中生物聚合物的胺基被质子化(即被激活)[22]。

无花果图6(B,E)显示了CS / GEL / H(H),CS / GEL / AV(AV),CS / GEL / H / AV(H / AV),蜂蜜浓度的薄膜的抗菌活性的结果。和AV(10%(w / v))。显然,蜂蜜在低浓度并与其他材料混合时,没有抗菌活性。蜂蜜的抗菌活性 金黄色葡萄球菌 和 P. aeruginosa 在浓度为20%时观察到。

根据结果​​,可以得出结论,CS / GEL / H / AV(H / AV)和CS / GEL / H(H)支架能够在感染部位预防革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长和增殖。 (图6(C,F)和表3)。

聚合物溶液的静电纺丝

使用静电纺丝检查了不同的元素 对于不含添加剂的聚合物溶液,最终将20kv电压,0.5ml / h的放电速率和14cm的喷嘴尖端和表面间隙作为生产均匀纤维的最佳参数(图1)。 7(A)).

如上所述,CS的水溶液由于其高粘度而不适用于静电纺丝。溶液粘度高的原因是NH之间有很强的氢键2 和CS链的OH基。为了促进CS静电纺丝,向溶液中加入PEO。这样做会降低CS的分子间/分子内粘度,并使溶液适合静电纺丝。 PEO分子附着在CS的主链上,并通过化合物的-OH基团与水分子之间的新氢键中断CS链的自聚集。

在其他研究中也有报道说,可以通过静电纺丝将杀死微生物的有毒溶剂用于制备纳米纤维。但是,由于这种溶液的毒性,所以在不使用任何添加剂的情况下,以CS溶解度允许的程度使用酸性乙酸(0.5M)。为了获得没有任何节点的均匀纤维,采用70:30的CS / PEO比。也可以将CS / PEO比为90:10进行静电纺丝。考虑到将蜂蜜和AV添加到溶液中,并且省略了有毒溶剂,这使电纺丝更具挑战性,因为不使用后者。

如SEM图像所示(图7(B)),蜂蜜2%会产生明显的结节。因此,静电纺丝不能用于高浓度的蜂蜜。

CS / PEO与蜂蜜,AV的静电纺丝,以及以1%w / v的比例混合作为添加剂的CS / PEO的静电纺丝,如图1和2所示。 7(C,E)。通过静电纺丝工艺形成纳米纤维,电压为21kv,放电速度为0.1ml / h,喷嘴表面间隙为15cm。

成纤维细胞培养

通过倒置显微镜拍摄的在具有CS / PEO / H / AV纳米纤维且不具有纳米纤维的CS / GEL / H / AV膜上生长的成纤维细胞的图像如图1和2所示。指示了8(A,B)和活细胞的百分比。在第二,第四和第六天结束时,超过90%的细胞还活着(表4)。

图8表示在含纳米纤维的膜上培养的成纤维细胞的SEM图像。图像中显示出纤维中出现的宽纤维细胞。显然,成纤维细胞在具有可接受的物理外观的含有纳米纤维的膜上生长。

成纤维细胞相对保留其外观,并发育宽,伸展和大。这些细胞也在纤维间发育,并表现出良好的粘合特性。这表明成纤维细胞已与纳米纤维有效相互作用,为细胞生长创造了良好的环境。

CS / GEL / H / AV薄膜的SEM图像

如图。 如图9所示,CS / GEL / H / AV薄膜是均匀的并且没有孔和裂纹。

溶血试验

溶血的 有和没有纳米纤维的薄膜的活性 on 血液 agar medium are shows in Fig. 10。 These results indicate that the samples are non-hemolytic.

结果表明,样品的溶血率远低于1%。这类似于阴性对照(图11)和(表5)。因此,样品具有优异的血液相容性,可用于医疗应用。

结论

总之,由CS / GEL / H / AV组成的多功能薄膜具有所有必要的形态和生物学特性。含有蜂蜜的薄膜具有抗细菌活性 金黄色葡萄球菌 and P. aeruginosa,大大提高了柔韧性和可拉伸性。在薄膜上添加AV可提供机械强度支持。这种复合材料是非溶血性的,并支持成纤维细胞的生长。考虑到薄膜的生物学特性,它们可用作治疗伤口,促进伤口愈合和抗菌涂层的生物材料。此外,该薄膜用作包含添加剂的CS / PEO纳米纤维的基础。因此,我们可以将药物装载到这种纳米纤维上,以用于各种医学用途。

致谢

作者要感谢Malek Ashtar大学的财政支持。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

 

 
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