基于金纳米棒/ GC 3N4复合材料的电化学检测慢性淋巴细胞性白血病

文件类型:原始研究文章

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1 伊斯兰阿扎德大学理学院化学系,伊朗纳贾法巴德,纳贾法巴德分校。

2 伊斯法罕大学化学系纳米技术实验室,伊朗伊斯法罕。

抽象

目的:随着癌症发病率的增加和早期发现对治疗的巨大影响并增加患者数量's life, many efforts have been devoted to making sensitive diagnosis systems. DNA as a biomarker for diagnosis of different types of cancers at the early stages of illness has attracted much attention.
方法:在这项研究中,使用Pb2 +修饰的磷酸钛纳米粒子和两个DNA作为捕获探针,开发了一种新型电化学生物传感器。大量的铅离子被固定在磷酸钛的表面,产生电化学信号。生物传感器电极的表面用金纳米棒/ GC 3N4复合材料改性。通过傅立叶变换红外光谱(FTIR),X射线衍射(XRD),场发射扫描电子技术研究了g-C3N4表面的官能团,尖端的化学组成,复合材料的形态和复合材料的元素组成。显微镜(FESEM),能量色散X射线光谱仪(EDS)。
结果:在EDS光谱中观察到C,N和Au的峰。 EDS光谱中Au峰的存在证实了由Au纳米棒和g-C3N4薄片形成的复合材料。该生物传感器的线性范围为0.6 nM至6.4 nM,对目标DNA的检出限为20 PM。
结论:最后,似乎用Au-nanorods / GC 3N4复合材料修饰的玻碳电极是早期癌症诊断的良好候选者。

关键词


介绍

医学领域最重要的研究之一是癌症研究。癌症的影响主要来自基因突变。最常见的白血病之一是慢性淋巴细胞性白血病(CLL),这种白血病在成人中会导致骨髓中称为B淋巴细胞的白细胞数量增加。 B淋巴细胞有助于抵抗疾病。癌细胞从骨髓扩散到血液,并可能影响淋巴结或肝脏和脾脏。 CLL导致低血球计数并削弱免疫系统[1]。 CLL发生率正在增加[2]。确定患者治疗方案的关键特征是癌症疾病的早期,有效和特异性检测[3]。生物传感器作为一种监测基因组突变的新型无创分析仪器,为癌症研究提供了有希望的进展[4]。使用纳米材料制造生物传感器以检测低癌细胞数会增加表面积以实现最大检测。金纳米颗粒是制备生物传感器的良好候选者,因为它们可以提供稳定的生物分子固定化,并保留其生物活性[5,6]。金纳米材料具有生物相容性,高稳定性和简单的制备方法。金纳米棒的表面化学性质允许通过强大的Au-S键连接各种双官能团(如核酸)。因此,通过使用金纳米棒可以提高复合膜在电极表面的粘附性[7]。已经合成了石墨烯/金纳米棒纳米复合材料,并用于制造NADH和乙醇生物传感器[8]。已经构建了具有金纳米棒的灵敏且稳定的无酶生物传感器[9]。制备了基于超灵敏石墨烯/金纳米棒/聚硫氨酸纳米复合材料的电化学DNA生物传感器,用于人乳头瘤病毒的检测[10]。

无金属石墨状氮化碳(g-C3N4作为一种由碳,氮和少量氢组成的聚合物,由于其价格便宜,热和化学稳定性高而备受关注。石墨碳氮化物可用于各种领域,例如水的光催化分解,有机污染物的光降解和能量存储。而且,由于其有效,强而稳定的电化学发光发射,因此是制造电化学发光传感器的良好候选者。 GC3N4 近年来已被用于制造生物传感器[11,12]。

电化学生物传感器因其操作方便,检测速度快,灵敏度高和成本低而受到关注[13]。它们适合用于开发便宜,便携式的疾病诊断设备[14]。制造用于检测特殊DNA序列的基于DNA的电化学生物传感器;将作为单链核酸的探针固定在固相支持物的表面上,并与被分析物中特异性单链DNA的靶标偶联。探针与靶标杂交后,氧化还原标记会产生相应的电化学信号[4,15]。氧化还原标记可以通过两种方式与DNA相互作用:a)与杂交双链DNA插入结合,b)与DNA链共价标记[15]。

纳米材料由于其独特的优势,为低成本,灵敏地检测生物标志物提供了现代方法。为了通过加载诸如染料,金属离子,寡核苷酸和量子点的信号标签来制备标签,已经使用了包括金纳米颗粒,碳纳米管,磁性的各种纳米材料。最近,以金属离子作为信号标签功能化的磷酸钛纳米球已用于某些电化学生物传感器中。磷酸钛可以负载适量的金属离子,并且可以通过方波伏安法(SWV)直接检测金属离子,而无需进行诸如金属预浓缩的处理[16-17]。

Zap-70,酪氨酸激酶蛋白对于T细胞信号转导必不可少,但在正常b细胞中找不到。识别不同形式CLL的预后标志物是B细胞中的ZAP-70 [4,18]。 DNA分析可区分具有不同生存时间的两种主要CLL类型。

在这项研究中,一个敏感的电化学生物传感器基于两个DNA作为靶标,并用Pb功能化的TiP纳米球2+ (TiP-Pb2+作为标记用于检测ZAP-70 DNA。 GCE的表面被Au纳米棒/ GC 改性3N4 综合。电化学信号由Pb提供2+ 离子结合到TiP纳米球中。

材料和方法

用料

这项研究中使用的合成生物素终止的DNA捕获,捕获DNA 1和靶序列(表1)购自Bioneer Corporation(韩国)。用水稀释所有寡核苷酸,并作为原液储存在冰箱中。通过混合NaH储备液制备具有不同pH值的磷酸盐缓冲盐水(PBS)2 PO 4 and Na2 高压氧 4 然后用NaOH(0.1 M)和H调节pH3 PO 4 (0.1万)。所有溶液均用Milli-Q水(18MΩ电阻率(cm电阻率)。三聚氰胺(C3H6N6),6-巯基-1-己醇(MCH),氯金酸(HAuCl4),聚(盐酸烯丙胺),牛血清白蛋白,多库酯钠,硝酸银(AgNO3),硼氢化钠(NaBH4)和所有其他试剂均由Sigma-Aldrich制备。

仪器

使用CuK在室温下记录样品的X射线衍射图(XRD)α辐射(D8Advance,布鲁克)。红外光谱是在FT-IR 6300上使用KBr作为参考样品在400-4000cm波长范围内获得的-1。通过配备有能量色散X射线光谱仪(EDS)的TESCAN(MIRA3)的场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察样品的形态和纳米结构。

所有电化学测量均在μ使用NOVA 1.8软件的Autolab III(Eco Chemie B.V.)恒电位仪/恒电流仪。利用的三电极系统包含参比电极(饱和甘汞电极),辅助电极(铂丝)和工作电极(d = 4 mm的改性玻璃碳电极)。报告所有关于饱和甘汞电极的测量电位。

GC 的合成3N4 nanosheets

散装g-C3N4 通过在高温下聚合三聚氰胺分子合成。将三聚氰胺在空气条件下于600加热°C 2小时,斜率约为5°C /分钟,在600下保持2小时°C为加热过程。所得产物为黄色。 GC3N4 纳米片通过剥落as获得–prepared bulk GC 3N在水里散装0.4克  GC 3N将功率分散在800ml水中,并将混合物超声16小时。的 不脱落  GC 3N4 通过离心去除[19,20]。

金纳米棒的合成

种子介导的生长方法用于金纳米棒的合成[21]。

种子溶液

将CTAB溶液(5 ml,0.2M)与5 ml的0.0005 HAuCl混合4,0.6 ml冷的0.01 M NaBH4 将其加入到搅拌的溶液中,导致形成棕黄色溶液。将种子溶液搅拌几分钟,然后保持在25℃°C[21].

生长液

将5ml CTAB(0.2M)添加到0.2 ml 0.004 M Ag(NO3)在25点解°C.然后加入5 ml 0.001 M HAuCl4。混合溶液后,70 μ0.0788 M抗坏血酸作为还原剂的变化 溶液的颜色从黄色到无色。

最后12μ在27-30时将1升种子溶液添加到生长溶液中°介质温度保持在27-30° C [21].

铅的合成2+ 功能化的TiP纳米球

对于合成TiP纳米颗粒,将5g的多库酯钠盐(AOT)溶于32ml的乙醇中,得到浑浊的溶液H3 PO 加入(6ml)。快速滴下1.75g钛酸四丁酯与32 ml乙醇的混合物。将混合物在80℃搅拌 °C持续6小时。为了除去残留的磷酸和表面活性剂,将产物用乙醇和水洗涤几次。然后1毫升的(40mg.ml-1将TiP纳米球的胶体混合物分散到30 ml的Pb(NO3)2 水溶液(10毫米)并在50℃下搅拌°C 1天。通过离心获得杂化纳米球,并用水冲洗几次。 TiP-pb的混合物2+ in water (20 mg.ml-1)已准备好。接下来,加入2 ml TiP-pb2+ 将杂种散布到2ml的聚烯丙胺盐酸盐水溶液中,并超声处理20分钟。在此阶段之后,将杂交体用去离子水洗涤,并分散在2 ml的戊二醛中并超声处理5分钟。然后,用DI和PBS洗涤杂交体3次。 600μL链霉亲和素蛋白溶液(0.01 mg.mL-1)已添加到产品中。将该分散液摇动6小时。通过离心分离产物,并用PBS漂洗几次,并悬浮在8mL的tris缓冲液中。

金纳米棒/ GC 修饰GCE3N4 composite

首先,为了获得电极的镜面状表面,用氧化铝将裸露的GCE完全抛光。–将水浆放在光滑的抛光布上。为了除去氧化铝残留颗粒,将GCE在蒸馏去离子水中超声处理5分钟,然后在氮气下干燥。 GC 的混合物3N分别制备(1.0 mg / mL的H2O溶液)和GNR(100 mg / mL的H2O溶液)。在使用前,将该混合物暴露于温和的超声处理5分钟。之后的4.0μ将l g-c4n3溶液涂在裸露的GCE的表面上,并保存在隔离容器中直至完全干燥。然后,4.0μL of the GNR solution 也被用于g-C的表面3N4 改良的GCE,并隔离在高湿度的容器中。在G-C表面稳定GNR后3N4 sheets, 5 μ将含有捕获DNA1(100 nM)的缓冲液L应用于  修饰的GCE表面,并在室温下在高湿度容器中孵育2小时。捕获DNA1的SH组附着在GNR表面。然后用洗涤液洗涤电极,并在6-巯基-1-己醇溶液中孵育5分钟。该电极用蒸馏水洗涤以除去疏松的吸附材料。

DNA杂交测定及测量程序

为了完成DNA杂交测定,GNR / GC 3N4 复合修饰电极与12μ含5升的混合物μl目标DNA(不同浓度或对照样品),5μL的捕获DNA2(10Μm), 1μL T4DNA连接酶(1000 UμL-1)和1μTBS的L在37时4小时°C完成杂交反应。接下来,将电极用TBS洗涤3次。接下来修饰的GCE与10μL TiP−Pb2+−37时链霉亲和素溶液°C.为了去除非特异性结合的结合物,用含%1牛血清白蛋白的TBS冲洗电极。电化学测量是在3 mL醋酸盐缓冲液(pH 4.6,0.2 M)中进行的[19]。

结果与讨论

表征

GC 表面的化学官能团3N4 通过FTIR光谱研究了具有高表面积的纳米片。 GC 的FTIR光谱3N4 如图1所示。 3100-3300 cm处的宽吸收峰-1 可以归因于两个来源:仲胺和伯胺的拉伸模式以及胺基之间的分子间氢键相互作用[22]。乐队在1200-1600厘米-1 是芳族氮化碳杂环中C-N-C拉伸振动的特征[23,24]。吸收峰集中在808 cm-1 与三嗪循环的平面外弯曲振动有关[25]。

为了表征TiP的晶体结构,获得了TiP的XRD图谱(图2)。 X射线衍射图中的所有峰都与菱形Ti明显匹配4P6O23,磷酸钛(JCPDS卡39-0004)。在20.6处观察到的峰°, 24 15°, 29.2°, 32.4°, and 36.4°分别对应于(104),(113),(024),(116)和(030)米勒指数。 Ti的微晶尺寸4P6O23 由Scherrer方程(等式1)计算,发现约为41.22nm。

 (1)

D是微晶尺寸λ是Co k的波长α radiation, β是主强度峰值的一半最大值的全宽,θ是吹牛的角度。

由金纳米棒/ GC 制备的场发射扫描电子显微镜(SEM)图像3N4 纳米复合材料(图3)。 SEM图像证实了该复合材料的纳米级尺寸。金纳米棒/ GC 的元素组成3N4 如图4所示,用EDS分析复合材料。在EDS光谱中观察到C,N和Au的峰。 EDS光谱中Au峰的存在证实了Au纳米棒和g-C形成复合物3N4 sheets.

合成后 混合铅的数量2+ functionalized 添加TiP纳米球,聚烯丙胺盐酸盐并共价结合到TiP纳米球的磷酸基团和聚烯丙胺盐酸盐的胺基团上。然后使用戊二醛作为交联剂 1TiP纳米球表面上的抗生蛋白链菌素蛋白。

传感器性能

金纳米棒/ GC 3N4 将复合物固定在玻璃碳电极(GCE)的表面上。然后将S终止的DNA Capture1连接到Au纳米棒/ GC 3N4 与金硫键。 DNA Capture1和DNA Capture 2分别拥有12个和11个碱基,它们分别与目标DNA互补。如果样品中存在靶标,则形成夹心结构。然后链霉亲和素在TiP-Pb表面2+ 杂合体附着在生物素上,生物素与DNA捕获2相连。6-巯基-1-己醇被用来阻断电极表面的非特异性位点。图5显示了分析物和探针的修饰电极和夹心结构的示意图。

通过测量Pb的电化学电流响应来完成目标DNA的定量2+。对于目标DNA的电化学检测,方波伏安法(SWV)是一种有效且灵敏的方法。电压扫描范围为-0.7至-0.1 V,脉冲幅度为25 mV,脉冲频率为15 Hz,安静时间为2 s。电化学反应记录在−0.41 V用于目标DNA的定量评估。测量不同浓度的靶DNA(6.4、5、4、3、1.8、1.2、1、0.8、0.6 nM),以获得靶DNA的浓度与电化学信号(电流)之间的关系。图.6描绘了随着靶DNA浓度的增加,修饰电极的SWV。

来自SWV的电流量显示与目标DNA浓度在0.6 nM至6.4 nM范围内具有适当的线性相关,且检测限为20 pM。通过Microsoft Office Excel获得最适合电流与目标DNA浓度的直线关系的线性方程。得到的方程为y = 4.6489x-0.2325,其中y是电流(μA)和x是靶DNA的浓度。回归相关系数(R2)约为0.9956。

该方法的精度通过对五个重复测量样品的评估来评估。 RSDs%(相对标准偏差)分别为3.2、1.6 and 1.6 分别针对10nM,20nM和30nM靶DNA。

结论

在早期阶段制造用于精确检测CLL的新型生物传感器非常有用。 Zap-70 已经证实DNA是CLL的预后因素。用金纳米棒/ GC 3N4复合材料修饰了GCE的表面。然后用两条互补链的Zap-70 DNA作为探针和Pb2+修饰的TiP纳米粒子作为信号单元被用于制造该生物传感器。 Zap-70 DNA的浓度与SWV峰值电流在0.6 nM至6.4 nM之间呈线性关系,检出限为20 pM。该生物传感器是用于检测Zap-70 DNA作为CLL生物标志物的选择性和灵敏生物传感器。

致谢

作者希望感谢Najafabad Branch, 伊斯兰阿扎德大学对此研究提供了部分支持。

利益冲突

作者宣称在这项研究中没有利益冲突。

 

 
9. N, Won Y-H, Huh K, Stanciu LA. Purdue e-Pubs Au nanospheres and nanorods for enzyme-free electrochemical biosensor applications Au nanospheres and nanorods for enzyme-free electrochemical biosensor applications. Biosens Bioelectron [Internet]. 2011 [cited 2020 Jan 7];26:4514–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2011.05.012
23. Lee S,Yu JS,Hwang S.通过氰胺聚合进行模板定向合成的高阶纳米多孔石墨碳氮化物材料改性查看项目粒径测定查看项目通过氰酰胺聚合进行模板定向合成的高阶纳米多孔石墨碳氮化物。 2006 [引用日期:2020年1月7日];可从以下网站获得:www.elsevier.com/locate/apsusc