绿银纳米颗粒与抗生素的协同活性

文件类型:原始研究文章

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1 印度巴拉那斯印度大学医学科学研究所生物化学系,瓦拉纳西,UP-221005,印度

2 印度巴拉那斯印度大学医学科学院微生物学系,瓦拉纳西,UP-221005。

3 印度巴拉那斯印度大学MMV植物学系,瓦拉纳西,UP-221005。

抽象

目的
本工作代表了使用Withania凝聚物提取物的银纳米颗粒的绿色合成及其抗菌性能。确定了银纳米颗粒对粪肠球菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,变形杆菌,鼠伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌的协同作用,添加剂,抑菌和杀菌作用。
方法
通过X射线衍射,透射电子显微镜,扫描电子显微镜和傅立叶变换红外光谱对绿色银纳米颗粒进行表征。琼脂稀释,最小抑菌浓度和细菌生长抑制方法用于测定银纳米颗粒的抗菌活性。进行分数抑制浓度指数法以检查共轭银纳米颗粒的协同活性。
结果
Withania 凝聚物提取物将硝酸银还原为银纳米颗粒,这通过颜色变化和光谱分析得到了证实。银纳米颗粒是结晶的,元素的和球形的。据报道,在银纳米颗粒中具有抗菌活性,这通过抑制区域和细菌表面的孔得以证实。与左氧氟沙星共轭的银纳米颗粒对被测细菌具有协同作用和累加行为。此外,据报道,银纳米颗粒的抑菌和杀菌特性较低(50 µg/ml) respectively.
结论
凝结线虫的酚类化合物负责形成银纳米颗粒。银纳米颗粒的抑菌和杀菌活性取决于其浓度。银纳米颗粒与抗生素的结合可能是有益的,因为它具有协同作用和对细菌的累加作用。

关键词


介绍

纳米技术是科学的一个引人入胜的领域,正在生物技术中产生新的应用&纳米药物为新型纳米颗粒的发展提供了鼓励[1]。物理,生物和化学方法用于合成纳米粒子,但是由于成本高,产率低和有毒的还原剂,化学和物理方法不是优选的[2-3]。在生物方法中,微生物和植物用于形成纳米颗粒。由于释放有毒化合物[4-5],因此在微生物的帮助下合成纳米颗粒不是优选的方法。基于植物的合成因其具有成本效益,易于获得,易于处理,生态友好,药用特性以及不需要无菌环境而受到关注[6]。各种报告已证实植物提取物合成了Au,Ag,Pd和Pt纳米颗粒[7]。 AgNPs已被用作抗真菌剂,抗菌剂,抗病毒剂,防垢剂,抗寄生虫剂,抗癌剂[8-10]。由于这些巨大的应用,AgNP在纳米医学领域起着重要的作用。各种报道证明植物提取物已用于合成银纳米颗粒。的植物提取物  马tana丹 [11],  橙子  peel [12], 菊花拉玛特 [13],洋葱[14],香蕉,印em和 田鼠 [15],咖啡和​​茶[16]大蒜[17]和  Withania  夜蛾属 [18]已经用于合成银纳米颗粒。天然化合物如Kefiran具有抗菌活性[19]。 紫薇 Dunal是印度阿育吠陀的一种著名药用植物,隶属于茄科。它在印度,巴基斯坦,伊朗和阿富汗发现。的 紫薇 提取物已被用于糖尿病,血液净化,伤口愈合,抗菌,抗真菌,保肝,降糖,降血脂,心血管和自由基清除剂[20-21]。各种文献已证明,将银纳米颗粒与抗生素结合可增强抗菌活性[22-25]。左氧氟沙星是一种广谱抗生素,对细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性)非常有效。该抗生素具有喹诺酮环结构(6-氟取代基和7-哌嗪基取代基)和亲水性。这种性质降低了它们穿过细菌细胞壁的趋势,并且还抑制了DNA促旋酶和细菌拓扑异构酶IV。进一步的左氧氟沙星已被用于抵抗尿路感染(UTI),肾盂肾炎,急性细菌性鼻窦炎和社区获得性肺炎[26]。因此,我们目前的工作开发了一种更环保的方法,用于使用 紫薇 及其抗菌活性。此外,测定了共轭银纳米颗粒与抗生素(左氧氟沙星)对细菌的协同作用和累加行为。

方法

凝固花With果实提取物的制备

凝结杆菌 该植物采自印度瓦拉纳西的Banaras印度大学的植物园,并经Banaras印度大学的植物学系NK Dubey教授鉴定。标本凭证编号  凝结杆菌 工厂是Solana.2020 / 1。然后将植物在40-45干燥 0在烤箱中C 7天。使用研磨机将该水果粉化,并通过将粉末在装有100 ml蒸馏水的500 ml锥形瓶中煮沸5分钟来制备6%的提取物。用Whatman滤纸(No.1)过滤其他提取物,滤液在4℃下保存 0C有待进一步研究[30]。

植物化学筛选

使用标准方法分析了提取物中的植物化合物(酚,单宁,四氢单宁,类固醇,萜类,蛋白质,碳水化合物和皂苷)的定性测试[20] [21] [30]。

苯酚和单宁的测定

2毫升氯化铁3 (2%)与1 ml提取物(6%)混合,观察溶液的蓝绿色或黑色。蓝绿色或黑色的出现证实了酚和单宁的存在[30]。

荧光素的测定

将1 ml提取物与几滴盐酸(1%)混合,煮沸几分钟。如果溶液中含有红色沉淀物,则提取物中含有邻巴丹宁[30]。

类固醇的测定

将1 ml植物提取物与2 ml氯仿,2 ml冰醋酸和2 ml Conc H混合2 SO4 solution. The presence of 绿色ish color of the solution is indicated the presence of steroids [30].

萜类化合物的测定

2 ml植物提取物,2 ml氯仿和1.5 ml Conc。 H2 所以 4 混合了。红褐色的发展表明提取物中存在萜类化合物[30]。

蛋白质测定

将1 ml提取物与2 ml茚三酮(0.2%)溶液混合,煮沸几分钟。紫色的出现表明提取物中存在蛋白质[20]。

碳水化合物的测定

将1 ml提取物与2ml Molish试剂混合并适当涡旋。然后加入2毫升H2 所以 4 溶液中观察到紫罗兰色环的存在,该环证实了提取物中碳水化合物的存在[20]。

皂苷的测定

将1 ml提取物与5 ml去离子水混合并剧烈振摇。然后形成稳定的泡沫,证实提取物中存在皂苷[21]。

银纳米粒子的绿色合成

将6%提取物(10ml)与1mM AgNO混合(90ml)在200ml烧瓶中,并使其在室温下反应。该提取物将硝酸银还原为银纳米颗粒(AgNPs),这可以通过溶液的可见颜色变化(黄色到深棕色)得到确认。然后取2 ml该溶液,并使用UV在200-800nm下记录吸光度–可见分光光度计(Systronics,AU-2701)。然后将溶液以5,000 rpm离心15分钟,并收集沉淀。再用5 ml去离子水洗涤沉淀3次,并以5,000 rpm离心[28]。

X射线衍射分析

进行粉末XRD分析银纳米颗粒(AgNPs)的晶体或无定形性质。使用CuK进行的粉末XRD型号no Bruker Advanced D8,Ecoα radiation (λ = 1.5418 Å) at 2θ 角度。然后将AgNP放入样品架中,并以1的速率扫描°每分钟30o to 70° [28].

透射电子显微镜分析

进行TEM以检查AgNP的形态。 TEM型号使用JEOL JEM 200 CX,其中将一滴AgNP放在网格上(涂有碳)。该格栅在灯下干燥过夜。然后,透射电子与AgNPs相互作用并形成图像,该图像由检测器检测[28]。

扫描电子显微镜分析

进行SEM以测定AgNP的表面形态。 SEM型号JEOL-MODEL 6390用于测定AgNPs的大小。然后使用硅晶片制备栅格,并将少量样品粉末放在栅格上,并在灯下干燥过夜。为了进行该分析,使用了加速电压(5-10 KeV)。还进行了SEM以分析AgNP对细菌的作用。然后将伤寒沙门氏菌用AgNPs处理2小时[28]。

傅立叶变换红外光谱分析

进行了FTIR,以检查提取物中可能存在的植物化合物,这些化合物可能导致AgNPs的减少,加帽和稳定。 FTIR(Varian Excalibur 3000,Palo Alto,CA)在4000-500 cm范围内进行-1 检查存在于AgNPs表面的可能的组成和官能团[28]。

抗菌分析

抗菌活性的筛选

提取物AgNO的抗菌活性3 针对AgNPs进行筛选 粪肠球菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,变形杆菌,伤寒沙门氏菌,  Vibrio cholerae . 将纯细菌培养物在Luria肉汤(琼脂固化)培养基上继代培养。然后将每种细菌菌株均匀地擦在琼脂平板上。然后10 µL 样品(提取物/ AgNO3/ AgNPs)滴在细菌的琼脂平板上。去离子水用作对照。然后培养皿保持在37℃°C持续24小时。在提取物周围的孵育抑制区之后,AgNO3 和AgNPs被测量[29]。

最小抑菌浓度的测定

肉汤微稀释法检测抗生素左氧氟沙星(P)AgNPs(Q)及其组合(P + Q)的MIC值。麦克法兰’将(0.5)标准细菌悬浮液吸移到96孔微量滴定板中。然后可变样品浓度(P / Q / P + Q)(0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024µg / ml)用于检查对细菌的抗菌活性 大肠杆菌,寻常型毕赤酵母,金黄色葡萄球菌, 伤寒沙门氏菌,霍乱弧菌和粪肠球菌 (concentration 106 CFU /毫升)。然后将细菌在37孵育 °C 持续24小时[28-29]。

抑制分数浓度指数分析

抑制分数浓度(FIC)是药物组合和单独使用的比例。每种药物(左氟沙星和AgNPs)的FIC值计算如下:

 

 

 

 

分数抑制浓度指数(FICI)是每种药物FIC的总和(P&问)。当与左氧氟沙星联合使用时,不同的值决定了AgNP的行为。如果FICI< 0.5, 协同作用 ; 0.5 ≤ FICI <2,添加剂;和FICI≥2,拮抗作用[25]。

细菌生长抑制分析

LB培养基用于确定银纳米颗粒对细菌生长的影响。然后将伤寒沙门氏菌菌落添加到LB(10 ml)培养基中,并置于37 oC,250 rpm,24小时。然后在LB培养基中稀释以保持0.05 OD (600纳米) (0.1 OD (600) represents the 10每毫升细胞数)。 50µAgNP(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100µ克/毫升)溶液与50 µl LB medium 和 0.5 µl伤寒沙门氏菌在96孔板中。然后使用Thermo Scientific Multiskan Ex系列Rs在600 nm处记录吸光度。 232 C Elisa阅读器在不同的时间间隔(0、1、2、3、4、5、6小时)[27]。

结果

植物化学筛选

植物化学筛选结果证实 凝结杆菌 提取物中含有多种植物化合物,如酚,单宁,四氢单宁,碳水化合物,蛋白质,类固醇和萜类化合物,而皂苷则不存在(表1)。

银纳米粒子的绿色合成

植物提取物将硝酸银还原成银纳米颗粒,这通过可见的颜色变化(浅黄色到深棕色)得以确认。光谱分析结果证实银纳米颗粒的合成在反应1小时后开始,合成在7天反应后完成(图1)。

X射线衍射分析

银纳米粒子的XRD结果包含在111、200和220处的平面。这些平面确认了形成的结晶银纳米粒子与标准银平面相匹配(图2)。

透射电子显微镜分析

TEM结果证实银纳米颗粒为球形(图3A),衍射环证实银纳米颗粒为多晶(图3B)。形成尺寸为10-40nm的可变尺寸的银纳米颗粒。但是20 nm大小的颗粒数量最多(图3C)。在3 KeV处出现了强烈的峰,证明银纳米颗粒是元素元素(图3D)。

扫描电子显微镜分析

SEM结果证实银纳米颗粒为球形(图4)。银纳米颗粒的抗菌活性也通过伤寒沙门氏菌细菌表面的孔形成而得到证实。银纳米粒子处理2小时后,会在孔隙中形成这种银纳米粒子[图2]。 5]。

傅立叶变换红外光谱分析

研究了AgNPs的FTIR结果,该结果表明吸收峰位于3477、3349、2917、2347、2208、2003、1657、1540厘米-1 (图3)。乐队在3477、3349、2917、2347、2208、2003和1657cm-1 were assigned to O–H拉伸(酚类化合物),N-H拉伸(伯,仲胺和酰胺),C-H拉伸(甲基),H-C = O:拉伸(醛),C≡N拉伸(腈),C≡C伸展(炔烃),C = O伸展(羰基)(图6)。由于多酚(酚和类黄酮)含有足够的羟基和羧基与金属离子形成络合物,因此提取物中OH基团的存在与硝酸银还原成银纳米颗粒有关。提取物的羰基(CO)与银具有很强的结合倾向,导致形成一层。该层防止了银颗粒的团聚,并且还充当了为银纳米颗粒提供稳定性的封端剂[31]。

抗菌分析

抗菌活性的筛选

结果表明,抑制AgNO的区域 3 和AgNPs对细菌的确认,证实了AgNO的抗菌活性3 和AgNP。 AgNP具有抑制区21 mm (大肠杆菌), 43 mm (霍乱弧菌),21毫米(粪肠球菌),14 mm (金黄色葡萄球菌),32 mm (伤寒沙门氏菌),21毫米(寻常疟原虫)。 AgNO3 具有15 mm的抑制区( 大肠杆菌 ),17 mm (霍乱弧菌),10 mm (粪肠球菌),11 mm (金黄色葡萄球菌),11 mm (S. Typhi), 11 mm (寻常疟原虫)。与AgNO相比,AgNP具有强大的抗菌活性3 并显示出比AgNO更大的细菌抑制区3. 当使用去离子水作为对照时,没有提取物具有抗菌活性(图7和表2)。

最小抑菌浓度分析

左氧氟沙星(P)的MIC值为2µg/ml ( 大肠杆菌 ),8µg/ml (霍乱弧菌),8µg/ml (粪肠球菌),1µg/ml (金黄色葡萄球菌),1µg/ml (S. Typhi), 32µg/ml (寻常疟原虫)。 AgNPs(Q)的MIC值为16µg/ml ( 大肠杆菌 ),16µg/ml (霍乱弧菌),32µg/ml (粪肠球菌),4µg/ml (金黄色葡萄球菌),32µg/ml (S. Typhi), 16µg/ml (寻常疟原虫)。共轭AgNPs的MIC值(P&Q) was 0.5µg/ml ( 大肠杆菌 ),8µg/ml (霍乱弧菌),0.25µg/ml (粪肠球菌),0.25µg/ml (金黄色葡萄球菌),0.25µg/ml (S. Typhi), 16µg/ml (寻常疟原虫)。该结果证明,共轭银纳米颗粒具有比P和Q更大的MIC值(表3)。

抑制分数浓度指数分析

结果证实了FIC值 左氧氟沙星(P)为0.25( 大肠杆菌 ),1 (霍乱弧菌),0.031(粪肠球菌),0.25 (金黄色葡萄球菌),0.25 (S. Typhi), 0.5 (寻常疟原虫)。 AgNPs(Q)的FIC值为0.031( 大肠杆菌 ),0.5(霍乱弧菌),0.007(粪肠球菌),0.062(金黄色葡萄球菌),0.007(S. Typhi),0.5(寻常疟原虫)。共轭银纳米颗粒的FICI值为0.281( 大肠杆菌 ),1.5 (霍乱弧菌),0.038(粪肠球菌),0.312(金黄色葡萄球菌),0.257 (S. Typhi), 1 (寻常疟原虫)。该FICI值证明,共轭银纳米颗粒具有针对 大肠杆菌,粪肠球菌,金黄色葡萄球菌  伤寒沙门氏菌 而对 霍乱弧菌  P. vulgaris  (表3)。

细菌生长抑制分析

结果证实AgNPs在30分钟后具有抗菌活性,而抗菌性能随时间增加(从2-5小时)增强对伤寒沙门氏菌的抑制。当AgNPs的浓度增加时,鼠伤寒沙门氏菌的生长曲线减小。 20µg / ml AgNPs会降低伤寒沙门氏菌的生长,而在50以上时µg / ml AgNPs杀死了细菌菌落。这些结果证实了低于20的银纳米颗粒µg / ml具有抑菌作用,高于50µg / ml具有杀菌作用(图8)。

讨论

酚类化合物 凝结杆菌 减少了 硝酸银 变成银纳米颗粒(AgNPs)(图6)。溶液的颜色变化和紫外可见光谱证实了AgNPs的合成[图。 1]。 AgNPs本质上是结晶的,这由SEM证明[图。 2]。 TEM结果证明银纳米颗粒为球形[图2]。 3A],单晶[图。 3B],可变大小[3C]和元素[图3B]。 3D]。 SEM结果也证明银纳米颗粒为球形[图2]。 4]。 AgNPs通过破坏细胞壁在细菌表面产生了孔,这是由SEM证实的。 5]。 FTIR结果证实 紫薇 包含不同类型的植物化合物,例如伯,仲胺和酰胺,醛,炔烃,酚类化合物,类黄酮和单宁酸[图10]。 6]。对伤寒沙门氏菌的抑制区 大肠杆菌,寻常型体育,金黄色葡萄球菌,霍乱弧菌 和  粪肠球菌 细菌被证实具有AgNPs的抗菌活性[图。 7]。左氧氟沙星,AgNPs及其结合物具有抗菌活性,MIC结果证实了这一点。众所周知,较低的MIC值将具有较高的抗菌活性。与抗生素共轭的银纳米颗粒(AgNPs-Levo)具有比AgNPs和左氧氟沙星低的MIC值,这证实了AgNPs-Levo具有更大的抗菌活性[表3]。 AgNPs-Levo的FICI值证实,与单独的AgNPs和左氧氟沙星相比,这种结合具有协同作用和加和作用等双重作用,因此是有益的[表3]。由于AgNPs的疏水性,Ag +的释放以及AgNPs和左氧氟沙星对细菌的作用方式,因此增强了AgNPs-Levo的抗菌活性[8]。对伤寒沙门氏菌的细菌生长抑制的结果已经证实,AgNP的抑菌和杀菌特性取决于AgNP的浓度。较低浓度的AgNPs(50µ克/毫升)起杀菌作用8]。

结论

The present work describes the simple, fast, cheap 和 eco-friendly 绿色 synthesis of AgNPs using the 紫薇。植物提取物含有导致减少AgNO的酚AgNPs。 AgNP具有抑菌作用。 AgNPs-Levo比AgNPs和左氧氟沙星对选定的细菌具有较强的抗菌活性。 AgNPs-Levo的协同作用和累加行为是由于AgNPs和抗生素的作用方式引起的。这种结合总是有益的,因为细菌不会产生对抗生素的抗性。

利益冲突

作者被宣布没有利益冲突,这项研究是真实的。

致谢

作者Anand Kumar Keshari非常感谢印度新德里印度医学研究理事会(ICMR)以高级研究奖学金(SRF)的形式提供资金。该研究工作的作者要感谢印度瓦拉纳瓦州Banaras印度大学的印度技术学院Incharge,中央仪器设施提供XRD,TEM,SEM和FTIR设施。

 

 
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30岁 Keshari AK,Srivastava A,Upadhayaya,Srivastava R(2018)。药用植物的抗氧化和自由基清除活性。药理和植物化学杂志。 7:1499-1504。