固体脂质纳米粒的制备,统计优化和体外表征,可作为透皮递送盐酸曲马多的亲水性化合物

文件类型:原始研究文章

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1 哈马丹医科大学药学院药剂学系,伊朗哈马丹

2 德黑兰医科大学药学院药剂学系,伊朗德黑兰

抽象

由于将亲水性药物包裹在固体脂质纳米颗粒(SLNs)中仍然是一个具有挑战性的问题,因此本研究的目的是制备含有盐酸曲马多作为亲水性化合物的SLNs。通过双乳化-溶剂蒸发技术补间80。通过中心复合响应表面(RSM)方法优化了纳米颗粒。自变量是GMS /卵磷脂比率和药物量,而依存响应是大小,多分散指数(PdI)和ζ电位。然后将优化的纳米颗粒冷冻干燥,并使用透射电子显微镜(TEM)检查其形态。最后,评估了纳米颗粒的体外药物释放曲线,并确定了释放动力学。优化后的SLN的粒径,PdI,ζ电势,包封率和载药率分别为131 17。25 nm,0.210.013,-11.21.04mV,89.42.38%和9.49±分别为0.14%。 TEM图像显示解聚的球形纳米颗粒。体外释放研究表明,曲马多持续释放超过72小时,且释放动力学最适合一阶和Korsmeyer-Peppas动力学模型。获得的结果表明曲马多作为亲水性药物可以适当地截留在表现出良好的理化性质的固体脂质纳米颗粒中。

关键词


介绍

盐酸曲马多是具有氨基环己醇化学结构的合成镇痛剂,主要用于术后疼痛控制以及通过阿片类药物和非阿片类药物的作用机制控制癌症引起的疼痛。曲马多的镇痛作用比吗啡大10倍左右,这使该化合物成为减轻疼痛的良好候选者。曲马多的非阿片类药物机制被认为是通过血清素能和多巴胺能受体的激动作用以及防止其再摄取,而阿片类药物机制是通过刺激 µ 受体[1]。口服后不久,O的活性代谢产物–去甲基曲马多,称为M1,这很强大 µ母体药物在肝脏中的首过代谢(FPM)会产生激动剂并引起成瘾特征[2]。曲马多和活性代谢产物M的化学结构1 are shown in (Fig.1). Although the compound exhibits less adverse effects than other opioids, the short plasma half-life (i.e. 4-6 hrs) and the potential for drug addiction are count as the major drawbacks of tramadol. 因此, preparation of a non-oral, sustained-release formulation which can bypass FPM effect will promote therapeutic efficacy and reduce addictive potential of tramadol [3].

固体脂质纳米颗粒(SLNs)于1990年推出,以替代乳液,脂质体和聚合物纳米颗粒,并且由于其易于制造,提高的稳定性和较高的生物相容性,这些纳米颗粒得到了广泛的研究[4]。这些纳米结构被指定为直径为10-1000 nm的球形颗粒,其中包含亲脂性基质样核,可使用表面活性剂[5,6]进行稳定化处理,并且可以掺入亲水性和亲脂性治疗性化合物[7]。这些纳米颗粒具有易于掺入透皮贴剂中的潜力,可提高曲马多的透皮递送效率[8,9]。

尽管已经成功开发出许多将脂溶性化合物掺入SLN中的方法,但是制备包含脂溶性药物的制剂更具挑战性。在制备SLN的过程中,脂溶性差的药物会从脂质基质中固有地排出到分散水相中。双乳化-溶剂蒸发(DESE)方法,其中通过产生W1/瓦/瓦双重乳液,W1 可以包封具有高水溶性的化合物,油相起扩散阻挡作用,可防止药物从W转运1 to W2 阶段[10,11]。在这项研究中,使用DESE制备了负载曲马多的SLN,并采用了中心复合实验设计以生产具有最佳物理化学特性的制剂。

材料和方法

用料

单硬脂酸甘油酯(GMS)购自Sigma™(美国密苏里州圣路易斯), 大豆卵磷脂(SL),吐温80和蔗糖由Samchun提供™(韩国首尔)。氯化钠,氯化钾,磷酸氢二钠(Na2高压氧4),二氢钾 phosphate (KH2PO 4)和分析级乙腈购自Merck™(德国达姆施塔特)。 盐酸曲马多由郑祝德波提供™ (China). 使用Milipore提供分析纯水®水净化系统。

包裹盐酸曲马多的固体脂质纳米粒的制备

盐酸曲马多负载的SLNs是通过DESE方法制备的[4]。简而言之,将各种量的GMS和大豆卵磷脂(50毫克)溶解在5毫升二氯甲烷(有机相)中。通过将不同量的盐酸曲马多溶解于2 ml去离子水中制备第一水相(W1),该去离子水中先前已通过0.22过滤  µ米注射器过滤器。然后使用均质器以20,000 rpm将第一水相(W1)乳化为有机相10分钟。然后,准备好的W1使用注射泵以2 ml / min的速度将/ O乳液添加到25 ml的吐温80(1%w / v)水溶液(W2)在高速匀浆(20,000 rpm)下保持匀浆15分钟。为了除去有机溶剂,通过Heidolph将制得的乳液蒸发。™(德国)旋转蒸发仪生产SLN。然后通过使用20,000 rpm离心将纳米颗粒沉降 a Beckman-Coulter Optima™ XPN-100超速离心机(美国乔治亚州) for 30 min at 4 °C,并用去离子水洗涤两次。然后将回收的纳米颗粒重新悬浮在3 ml的5%(w / v)蔗糖中,并在-20°C下冷冻°最后冻干前于-40°C°C for 48 h.

反相液相色谱法定量曲马多

使用Shimadzu通过先前报道的RP-HPLC方法[12]对盐酸曲马多进行定量™ LC-20AD HPLC 装有SPD-10A vp UV-Visible检测器的系统(日本京都),其波长设置为270 nm。 Shimadzu ODS C18色谱柱(250毫米×施加4.6mm)作为固相。流动相由水和乙腈(10:90)组成。泵流量设定为0.5 ml min-1。使用实验室解决方案自动整合峰®软件。该方法在1到100之间表现出良好的线性µg / ml,具有回归系数(R2)的0.9991。检测限(LOD)和定量限(OQ)由信噪比确定,报告为0.11µg/ml and 0.9 µ克/毫升。将去离子水用作制备曲马多HCl工作标准品的溶剂。

纳米粒子的表征

使用Malvern通过动态光散射(DLS)确定纳米颗粒的平均粒径(Z-平均值)和多分散指数(PdI)®Zetasizer- Nanosizer(Malvern®仪器,英国)。使用Smoluchowski使用纳米粒子的电泳迁移率通过同一仪器评估纳米粒子的Zeta电位’s equation.

EE%和LE%的百分比是通过测定透明上清液中的药物含量间接计算得出的,该上清液是将新鲜制备的胶体纳米悬液离心后获得的。通过HPLC进行上清液中游离药物含量的分析。然后,使用以下方程式通过从总药物含量中减少未捕获的药物来计算EE%和LE%:

 (1)

 

(2)

 

实验设计研究

在13个具有不同自变量值的集合中进行了中央复合设计实验。根据先前作为初步研究进行的分数阶乘实验设计(数据未显示),吐温80和大豆卵磷脂的量保持恒定在1%w / v和50 mg,而GMS与大豆的比率卵磷脂以及药物的数量各不相同。由初步研究确定的自变量的范围和约束总结在表1中。各种成分的不同实验运行,如F1 to F13 设计(表2)并进行实验准备。所有测量均重复三次。使用设计专家对所有结果进行统计分析®.

在模型拟合分析中,实验数据包括粒径(Y1),PdI(是2)和zeta电位(Y3)由软件处理,并且为每个响应确定了最合适的数学模型。显着性级别设置为 0.05。通过逐步多元回归分析,进一步将每个显着影响的系数用于简化公式。通过使用3-D响应曲面图直观地解释了自变量之间的相互作用。

为了验证所提出的模型和评估预测误差,建议通过五次实验制备建议的优化配方,并通过确定其粒径,多分散指数(PdI),ζ电位(mV),包封率(EE% )和加载效率(LE%)。预测误差%是根据以下公式(等式3)计算的:

 (3)

 

冷冻干燥纳米颗粒

SLNs的冷冻干燥是根据实验制备的纳米颗粒的优化配方进行的。在冷冻干燥过程之前,将沉淀下来的优化纳米颗粒用5%(w / v)的蔗糖作为冻干保护剂进行重构。然后,将再分散的胶体悬浮液用Operon冷冻干燥。™冷冻干燥机(韩国FDB 5503)。冷冻干燥后,将冻干的SLNs在mili-Q水中重构,以重新评估包括粒径,PdI和Zeta电位在内的参数。通过使用SPSS进行的两个独立于样本的t检验比较冻干前后纳米颗粒的特性,还研究了冻干过程对纳米颗粒理化特性的影响。® software (V16.0.0).

颗粒形态的测定

通过透射电子显微镜(TEM)对冻干的纳米颗粒进行形态学检查,该透射电子显微镜通过TEM进行。 蔡司EM10C 100kV(德国)。实验之前,样品用多孔碳涂层网格Cu Mesh 300涂层。

体外释放研究

研究了曲马多从胶体悬浮液中的释放曲线 体外 在水槽条件下使用透析袋。 pH调节至7.4的磷酸盐缓冲盐水用作释放介质[13]。将相当于2.5 mg盐酸曲马多的含曲马多的SLNs胶体悬浮液的适量放入透析袋(MWCO 12 KDa)中,然后浸入200 ml的预热磷酸盐缓冲液中,保持在37±2°于100rpm搅拌的同时保持在100℃。在预定的时间;收集一毫升培养基,同时用等量的新鲜制备的预热缓冲液代替。使用配备有设置在270 nm的UV检测器的HPLC定量收集的样品中他马多的浓度。

为了确定释放动力学,将数据拟合到各种释放动力学模型,包括零阶,一阶,higuchi,korsmeyer-peppas和hixon-crowell模型,并使用Sigma-plot研究它们的适当相关系数® 软件(版本10.0.0.54)[14]。

统计分析

在本研究中,所有实验均一式三份进行,除非另有说明,否则均需进行五次实验。使用SPSS的两次独立样本t检验比较两组数据® 软件(V.16.0)。中央复合实验设计和模型拟合由设计专家完成® software (V.7.0.0).

结果与讨论

固体脂质纳米粒的制备与表征

在这项研究中,中心复合设计用于统计优化的固体脂质纳米颗粒的制备,并评估所有主要因素的影响以及可能的二元相互作用对预定反应的影响。 Therefore, 从装有曲马多的SLN中制备了13种配方,并进行了实验。在各种公式中,自变量的值和相关的实验获得的响应(即F1-F13(如表2所示)。

在这项研究中,使用设计专家对响应进行分析™软件,显示所有因变量,包括粒径(Y1),PdI(是2)和zeta电位(Y3)拟合到具有显着模型p值(p <0.0002)。表3总结了所提出模型的统计和数学特征。

颗粒大小

获得的平均粒径范围为235的粒径值±۲۶.۵ nm(即配方F5)至1075±۱۹.۸ nm(即配方F3)显示在(表2)中。为了预测粒径, 应用软件执行的统计分析来建立适当的显着拟合模型。拟合模型的特征总结在表3中。数据方差分析表明,所有独立因素的线性系数以及药物剂量的平方系数(X 22)很重要(p< 0.001)。但是,在两个自变量之间未发现明显的二元相互作用(p>0.05)。重要变量的粒径系数(Y1)显示在等式中。 4如下:

Y1= + 283.74 +(165.77 * X1)-(205.35 * X2)-(93.25 * X1。X2)+(198.92 * X22(4)

哪里:

Y1:粒径;

X1:GMS /卵磷脂比率的系数;

X2:药物用量系数;

X22:药物量的平方系数

X1。X2:二元相互作用系数;

如方程式所示和3D响应表面图所示(图2(a)),可以观察到通过增加GMS /卵磷脂(X1),则粒径值会大大提高。此外,在初步的分数阶乘实验设计研究中(数据未显示),结果表明,通过将GMS /卵磷脂比提高至5.0,颗粒尺寸增加到7,000 nm以上。单硬脂酸甘油酯作为中心核形成SLN的脂质基质。因此,明智的做法是,在更高的GMS /卵磷脂比例下,可以观察到粒径增加[15]。这种现象与以前的研究非常吻合,先前的研究表明SLNs的大小对作为脂质基质的GMS量有依赖性,并且据报道,在高浓度的GMS中,由于脂质的聚结,可以获得较大的颗粒。矩阵[16]。根据斯托克’根据定律,可以通过考虑制得的乳液的内外相之间的密度差异来证明其合理性。 此外,Mehnert和Mader [17]的研究表明 通过增加纳米颗粒的脂质含量可以增加SLN的粒径。这可能归因于内相粘度的增加,因此由于增加脂质的量[15,18]而导致均质效率降低。 此外,研究表明,在较低的脂质含量下,表面活性剂稳定颗粒的能力得到增强,因此获得的颗粒更小[19]。

另一方面,如图2a所示,尽管通过将药物量从10毫克增加到大约20毫克来显着减小颗粒大小,但是通过进一步增加药物浓度直至30 mg,SLN的颗粒大小略有下降。

多分散指数(PdI)

随着PdI趋于零,纳米悬浮液的均匀性变得更高(Mahjub R等人2016)。如表2所示,实验观察到的PdI为 0.145±0.002(即配方F7)至0.899±0.001(即配方F1)。为了预测PdI值, 应用软件执行的统计分析来建立适当的显着拟合模型。拟合模型的特征总结在表3中。数据方差分析显示,所有独立因素的线性系数,GMS /卵磷脂的平方系数(X12)以及两个独立因子(X1。X2)很重要(p<0.004)。 pdI(Y上的显着变量的系数2)显示在等式中。 5如下:

Y2 = +0.62+(0.072*X1)+(0.21 * X2)+(0.11 * X1。X2)-(0.16 * X12(5)

其中:

Y2:纳米颗粒的多分散指数;

X1:GMS /卵磷脂浓度比的系数;

X2:药物用量系数;

X1。X2:二进制相互作用的系数;

X12:GMS /卵磷脂比率的平方系数;

如3D响应表面图所示(图2(b)),在最高GMS /卵磷脂比率(即1.0)下,多分散指数急剧增加,随后药物剂量从10 mg增加到30 mg 。但是,在最低的GMS /卵磷脂比率(即0.2)下,增加药物用量会导致PdI略有增加。另一方面,在最低或最高剂量的药物中,将GMS /卵磷脂比值从0.2提高到0.6可能导致PdI略有增加。但是,随着比率的进一步增加,PdI值急剧下降。

Zeta电位

如表2所示,实验观察到的Zeta电位在-34.25之间变化±4.33 mV(即配方F10)和-3.70±0.61 mV(即配方F7)。对于zeta电位的预测,应用软件执行的统计分析以建立适当的有效模型。拟合模型的特征总结在表3中。数据方差分析显示,所有独立因素的线性系数和GMS /卵磷脂的平方系数(X12)很重要(p<0.004),则认为两个自变量之间的二进制交互作用不显着( p>0.1)。关于zeta势的重要变量的系数(Y3)显示在等式中。 6如下:

Y3= -10.106– (9.134* X1)+(0.284 * X2) – (13.169* X12(6)

哪里:

Y3:纳米粒子的ζ电势;

X1:GMS /卵磷脂浓度比的系数;

X2:药物用量系数;

X12:GMS /卵磷脂比率的平方系数;

正如3D响应表面图所示(图2(c)),通过增加GMS /大豆卵磷脂的比例,ζ电位显着下降。建议增加脂质浓度的结果是,施加负电荷的GMS的表面积累会增加,因此可以预期,在更高的GMS /卵磷脂比率下,颗粒的zeta电位会变得更负。

另一方面,图中显示出通过增加药物量,颗粒的ζ电势略有增加。考虑到 曲马多的化学结构(图1(a)),该化合物由于伯胺基团的电离而带有正电荷。尽管建议该药物主要掺入内部水相中,但以大量药物存在,但也提出了某些曲马多分子的表面积聚。因此,通过增加药物的量,观察到颗粒的ζ电势由于带正电荷的曲马多的表面结合而增加。

优化和模型验证

SLNs的理化特性的优化是使用中央复合响应面方法根据实验数据的统计和数学建模进行的。制备SLN的优化和预测参数显示在(表 4)。为了确定模型的有效性并计算适当的预测误差,准备了建议的优化配方并进行了实验表征(n = 5)。观察到的响应和预测误差的值在(表 5)。如表所示,对于所有响应,计算出的预测误差均低于10%,表明所提出模型的正确可预测性,效率和充分性。

胶体系统的大小,截留效率(EE%),载药量(DL%)和Zeta电位被认为是最重要的物理化学特征。因此,优化的纳米颗粒的大小确定为131±17.25 nm,具有高度的血源性。计算和确定的优化SLN配方的EE%高达89.4±2.38%(表5)表明曲马多盐酸可以成功 高效地封装到纳米结构中。在任何药物输送系统中,都希望获得最高的EE%。 EE%的值越高,表示治疗剂进入颗粒状载体的负载越高,因此可以使系统更有效地产生更多治疗效果。由于EE%在药物载体的开发中的重要性,Malekpour等人。 [20]应用人工神经网络(ANN)方法来预测和优化包裹姜黄素作为治疗剂的mPEG-PLGA纳米颗粒的包封率。此外,Shahsavari等。 [21]研究了人工神经网络在优化由壳聚糖季铵化衍生物组成的胰岛素纳米颗粒的大小,PdI,ζ电位和EE%中的应用。负载效率(LE%)也是表征纳米颗粒的有效参数,在本研究中,报道为9.49±0.14%(表5)。颗粒的ζ电位被认为是预测胶体分散体稳定性的良好指标[22]。 因此,由于之间的显着静电排斥力,在高ζ电动势(正或负)中不太可能发生颗粒聚集 颗粒[23]。因此, zeta电位值高于+10 mV或低于10 mV的纳米颗粒表现出高稳定性[24]。如表5所示,优化的SLN的Zeta电位确定为-10.8±1.04 mV可以确保负载盐酸曲马多的SLN具有适当的稳定性。根据先前的研究,ζ电位的负电荷与固体脂质纳米颗粒中带负电荷的脂质的表面积累有关[25,26]。

纳米粒子的冻干

研究了冻干过程对固体脂质纳米颗粒特性的影响,包括粒径,PdI和ζ电位,并在表1中说明了适当的结果。 6)。先前的研究表明,与单糖对应物(如甘露醇,山梨糖醇和海藻糖)相比,二糖(如蔗糖)更有效的冷冻保护剂,因此在冻干过程中在保留纳米颗粒的理化特性方面表现出更高的效率[27]。

如表6所示,纳米粒子的尺寸从 ۱۳۱±17.25nm to 186± 26.31 nm (p < 0.05),在冻干期间。另一方面,虽然粒子的PdI没有明显变化( p>0.05)冷冻干燥的结果是,粒子的Zeta电位从-11.2显着增加±۱.۰۴ mV to -۳.۷±۱.۹۸ mV. 确定ζ电位是考虑冷冻保护剂分子与纳米颗粒表面之间最终相互作用的有效方法[28,29]。可以通过考虑蔗糖的表面积累作为冻干保护剂并掩盖脂质的负电荷来证明负表面电荷的显着减少是合理的[30,31]。

形态学研究

从透射电子显微镜获得的优化的SLN制备图像如图( 3)。如图所示,TEM图像显示未聚集的球形固体脂质纳米颗粒的形成,其合适的直径与通过光子相关光谱法(PCS)获得的数据完全一致。

体外释放研究

的 体外 release of 在调节至pH值为7.4的磷酸盐磷酸盐缓冲液中评估了来自优化纳米颗粒的曲马多HCl。结果如图( 4如图所示,释放曲线表明曲马多从纳米颗粒和58.32中缓慢且持续释放±۳.۶۴٪, ۷۳.۶۵±۵.۵۷٪ and ۷۸.۲۱±۳.۱۱٪ of the 包埋的药物分别在孵育后24小时,48小时和72小时内释放。同样,各种研究报道了包埋在SLN中的药物的缓慢和延长释放行为[32-35]。在Mueller等人进行的研究中。 (2000),SLNs被建议作为延长药物释放的合适载体。在Kushwaha等人进行的研究中。 [35],药物从固体脂质纳米颗粒缓慢释放是通过增加扩散屏障的形成和脂质壳的阻滞作用来证明的,脂质壳的阻滞作用不允许周围的水介质渗透颗粒内部并通过溶解机理释放包封的胶囊。

获得的 体外 数据经历了不同的数学动力学模型,包括零阶,一阶,Hi口,希克森 –Crowell和Korsmeyer-Pepas使用Sigma-plot® 软件(版本10.0.0.54)。如表7所示,优化的SLN制剂的释放动力学和Korsmeyer-Peppas释放动力学模型最适合一阶。在Korsmeyer-Peppas方程中,n是释放指数,它确定释放是否为菲克扩散(n<0.5),异常扩散(0.5< n <1.0),案例II传输(n = 1.0)和超级案例II传输(n>1.0)在球形药物输送系统中[36]。在这项研究中,释放指数计算为0.4281(表7),它描述了由一级释放动力学模型解释的菲克扩散机制。同样,在Priyanka和Hassan [37]和Kakkar等人进行的研究中。 [38],提出了一级动力学分别用于从SLNs中释放孟鲁司特和姜黄素。

结论

本研究着重于准备和 体外 通过中央复合设计优化了含盐酸曲马朵的SLN的表征。还研究了包括GMS /卵磷脂比例和药物用量在内的配方变量对纳米颗粒理化性质的影响。优化的纳米粒子的特征是尺寸最小,PdI最低,而它们的zeta电位应在-20 mV至-10 mV的范围内。纳米颗粒的形态学研究表明,形成了未聚集的,尺寸均匀的球形颗粒,表面光滑。 体外 进行释放研究 优化了含曲马多HCl的SLN,结果显示 从纳米颗粒持续释放治疗化合物长达72小时。释放动力学被认为是一阶的。

尽管获得的数据表明,固体脂质纳米颗粒可以被视为制备透皮递送盐酸曲马多作为亲水化合物的媒介物的替代方法,并且药物在内部水​​相中的包封可以保护治疗剂免受环境降解,但是纳米颗粒在药物贴剂中的结构稳定性尚待研究。此外,从临床的角度以及为获得更高的疼痛治疗效果,建议最终剂型可同时包含速释制剂(即曲马多作为游离溶液)和渗透促进剂,以减轻急性疼痛作为长期释放的固体脂质纳米颗粒,可用于治疗慢性疼痛。最后,将纳米颗粒掺入药物贴剂可能会改变曲马多的释放速率。因此,应评估最终剂型的释放曲线。

致谢

这项研究是作为Mina Abbasnia的Pharm.D论文完成的。这项研究是在伊朗Hamadan的Hamadan医学大学的研究与技术副主任的财政支持下得以实现的。 950228795]。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

 

 
[3] Olin BR。中央镇痛药,见M.R.Riley(编),《药物事实与比较》,第54版,Wolters Kluwer,圣路易斯。 2000; 817–818.
[15] ShahR等。使用粒度和zeta电位对固体脂质纳米颗粒进行优化和稳定性评估。物理科学学报,2014; 25(1):59-75。
[20] Malekpour MR等。各种参数对mPEG-PLGA纳米颗粒包封效率的影响:人工神经网络。应用化学生物界面研究,2018年; 8:3267-3272。
[23] Mueller RH,Maeder K,Gohla S.用于控制药物递送的固体脂质纳米颗粒(SLN)–对最新技术的评论。欧洲药物和生物制药杂志,2000年; 50(1):161-177。
[31] Al-Qushawi A等。三种载有替米考星的脂质纳米颗粒的制备和表征:理化性质和体外抗菌活性。伊朗药物研究杂志,2016年; 15(4):663-676。