在地中海贫血模型中,使用被桃金娘(Myrtus communis extact)的单宁部分修饰的银纳米颗粒可过量还原铁离子

文件类型:原始研究文章

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1 Mazandaran医科大学药学院毒理学和药理学系药物科学研究中心,伊朗萨里

2 Mazandaran医科大学药学院药物化学系血红蛋白病研究所药物科学研究中心,伊朗萨里

3 伊朗伊朗德黑兰沙赫德大学医学院微生物学系

4 萨里(Sari)萨里(Sari)农业科学与自然资源大学基础科学系

5 伊朗萨里,医学科学大学Mazandaran,公共卫生与健康科学研究中心医学昆虫学和媒介控制系

6 伊朗萨里萨那高等教育学院生物系

抽象

目标:如今,铁离子中毒已成为地中海贫血和与常规输血相关的各种贫血的治疗和治疗的关注焦点。由于当前药物的主要副作用,应将其替换为更安全的替代品。因此,在这项研究中,作为一种新兴的观点,对功能化的杂化银纳米颗粒在动物地中海贫血模型中进行了研究,以吸收过量的铁离子并将其去除。方法:使用桃金娘叶甲醇提取物(MC-AgNPs)绿色合成银纳米颗粒。交付了基于负载有银纳米颗粒的可水解单宁基质的杂化纳米吸附剂,用于在铁过量的地中海贫血模型小鼠中尝试体内铁螯合。在铁负荷过高的小鼠中,每周四次腹膜内注射MC-AgNPs和延缓给药,持续一个月。分别借助等离子光谱显微镜和Fe3 +离子测量套件评估血清中的总铁和Fe3 +含量。另外,通过自动分析仪评估肝酶水平。同样,通过使用基于相应试剂盒的自动分析仪评估肝酶水平。通过普鲁士蓝染色研究肝脏组织的形态学转变。结果:与铁超负荷小鼠相比,用MC-AgNPs治疗的小鼠血清铁含量明显降低。 MC-AgNPs显示出令人满意的螯合小鼠体内过量铁的功效。结论:该方法可被认为是降低体内过量铁水平的一种竞争选择。

关键词


介绍

在一种病态甚至死亡中,有毒铁离子的机会性沉积助长了不止一种人类疾病的先决条件。铁3+ intoxication is the center of attention of one of a kind interest in view that it might likewise be managable to fix through 螯合 在里面 body. For example, 地中海贫血 is first and foremost, and different kinds of anemia are stipulations dealt with with normal blood transfusions. These generally end result in Fe3+ 超负荷,其次是氧化应激和内分泌器官,肝脏甚至智力的退化。这些先决条件的理想治疗方法是使用铁螯合剂。铁螯合疗法已经作为治疗地中海贫血和其他类型贫血患者的首选疗法已长期使用。用于治疗和治疗地中海贫血和其他基于输血的贫血的当代铁螯合剂包括延缓(DFO),去铁酮(L1)和地拉罗司(ICL-670)。尽管这些治疗剂非常有效,但它们具有不同的作用,因此必须以更安全的选择进行交换[1]。

同时,基于纳米技术的产品可以帮助减少治疗性化合物的有效剂量并减轻其毒性,从而达到生物治疗标准[2]。诸如银纳米颗粒(AgNPs)之类的金属纳米颗粒由于其独特的性能,高吸附能力,较大的(表面积/体积),较高的分散度,表面可改性性和相对较低的成本而得到了研究[3]。这些纳米粒子通常包含零金属,以吸收被污染水中的重金属离子[2]。最近,人们提出了AgNPs作为一种有前途的技术诀窍,并且对于消除独特的金属离子(如As(V),Cd(II),Hg(II),Cr(VI),Ni(II))有着非常梦幻的愿望,水性选项中的Pb(II),Co(II),Al(III)和Fe(III)[2-10]。因此,我们决定使用上述方法吸收过量的铁离子,并在动物地中海贫血模型的体内条件下将其除去。注意,使用功能化的杂化纳米颗粒在体内条件下吸收过量铁离子的领域是新兴的领域。

通常,裸金属纳米粒子在最佳尺寸范围内具有纳米粒子固有的不稳定性,并且易于形成附聚物。它们在化学上也具有高反应性,并且在空气中容易被氧化[11,12]。所有这些限制了它们的实际应用。在这方面,生物聚合物(例如,多酚类化合物)的应用通过连接纳米颗粒的生物聚合物官能团赋予纳米颗粒的可能性,大大提高了纳米颗粒的可用性[13,14]。多酚化合物虽然可以稳定金属纳米颗粒,但可以在水性介质中与可用的金属离子形成络合物,然后可以在其表面还原这些离子,从而将其从水性介质中去除[15]。近年来,由于结合了两种组分的引人注目的功能性而获得的改善的物理和化学特性,对由包裹在有机分子中的金属纳米颗粒组成的纳米颗粒进行了广泛的研究[10]。由于生物相容性,成本效益和相对较长的使用寿命,生物合成是较好的替代化学方法的方法。不同的材料被归类为用于纳米颗粒合成的生物材料,包括植物提取物和微生物酶。其中,植物提取物由于其生物可更新性,其植物化学化合物的性质以及为大规模生产提供可持续解决方案的能力而备受关注。[16]在使用的各种生物聚合物中,可水解的单宁酸是一种经典的多酚化合物,由鞣花酸/没食子酸酯葡萄糖组成的混合鞣花单宁/没食子单宁[17],被认为是制备和稳定银纳米颗粒的潜在非常好的抗氧化剂。单宁已显示出比类黄酮和酚酸更强的抗氧化活性[18]。例如,单宁酸(作为可水解单宁的代表)可以通过与铁离子形成络合物来阻止芬顿反应中羟基自由基的产生[19]。因此,富含单宁的植物提取物可能能够控制芬顿反应的毒性。

在本文中,我们使用了 桃金娘 methanolic leaf extract (MCLE), which was the hydrolyzable tannins of the main metabolites present 在里面 plant extract (~80%) for biosynthesis of silver 纳米粒子 [20, 21]. In addition, 桃金娘 具有广泛的药理和治疗效果,包括抗氧化剂,抗糖尿病药,抗微生物药,抗癌药和肝脏保护药,在全球范围的传统医学中使用[22]。人们不仅考虑将这种植物用于银纳米颗粒的合成,还考虑了其​​与由纳米颗粒引起的与氧化应激相关的预防性疾病。

Nowadays, there has been growing interest in using herbal products, which are safer than chemical synthetic products. Accordingly, the study about of biological synthesized AgNPs is of unique significance as they commonly include giant quantities of biologically active compounds. Due to the high tannin contents 在里面 surface coating of 纳米粒子 and the subsequent good antioxidant activity of the 纳米粒子, these functionalized hybrid nanomaterials based on nano sized zero valente Ag entrapped in tannin matrix were introduced as a test to chelate iron in vivo. In our opinion, the current find out about is the first to check out the capacity of 桃金娘-合成的银纳米颗粒(MC-AgNPs)在铁过载的小鼠模型中螯合过量的铁。

材料和方法

所用材料

在本研究中,使用了无需纯化即可使用的高纯度分析级材料。硝酸银和氢氧化钠购自默克公司(德国)。为了校准,从德国默克公司购买了标准铁溶液作为硝酸中的铁存储溶液(0.2%w / v)。所需的去离子蒸馏水由Millipore SAS 67120(法国)提供。人肝癌(HepG2)从伊朗牧场研究所获得。

桃金娘座银的生物合成0 nanoparticles

Silver 纳米粒子 were synthesized 在里面 same way as in our previous work [13]. Briefly, after preparing the extract solution (50 mL, 4x10‒3 gL‒1),将pH升高至10,然后将所得的透明提取物逐滴添加到AgNO中3 温度为65的溶液(50 mL,40mM)°C(200 rpm)远离光线。 AgNO的颜色变化3 溶液变成黄棕色至深棕色表明形成了AgNP。反复离心后,纯化所得的AgNPs(20,000×g,20分钟),将沉淀在(去离子水/乙醇)中洗涤四次并纯化。将去污后的沉淀重新分散在生理盐水中进行进一步研究。生物合成的MC-AgNPs本质上是双相的(基于XRD图),球形的结构具有几乎均匀的尺寸分布(基于SEM结果)。

纳米颗粒的核心涂有一层透明的有机层,该层与单宁分子相同(基于TEM图像)(图1)。通过动态光散射技术测得的MC-AgNPs的流体动力学直径为142 nm,核心(纳米Ag0) was 30 nm (TEM) and shell (Tannin biomolecules) was 112 nm, corresponding to the effective size of 纳米粒子 in drug delivery (50-200 nm) [16, 23, 24]. The zeta 潜在 of the MC-AgNPs was -45.0mV [13].

体内 Study design

生化和组织病理学研究正在对白色NMRI大鼠小鼠的雄性进行(20–25克)。根据Mazandaran医科大学进行的所有动物操作’s《伦理委员会与实验动物合作的准则》(2012年第911号批准)。将小鼠分为9个实验组,每组6个,分别进行腹膜内注射:第1组—对照(生理盐水); 2组—铁超载(100 mg / kg /天的右旋糖酐铁); 3组—铁超载+ DFO(1 mg / kg /天); 4组—铁超载+ MC-AgNPs(50 mg / kg /天); 5—铁超载+ MC-AgNPs(100 mg / kg /天); 6—铁超载+ MCLE(50 mg / kg /天); 7—铁超载+ MCLE(100 mg / kg /天); 8—MC-AgNPs(100 mg / kg /天); 9—MCLE(100 mg / kg /天)。为了产生过量的铁,每周五天连续4周进行注射,然后中断一个月以平衡过量的铁。这是一组小鼠以相同方式接受生理盐水的时候。在第三个月,铁覆盖的小鼠被随机分为八组。腹腔注射DFO,纳米颗粒和植物提取物进行了一个月的治疗。第十二周结束后,用乙醚对小鼠实施安乐死并采集血液样本。分离血清样品以测量铁含量,血清天冬氨酸转氨酶(AST),丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的水平。取出肝脏并保存在10%福尔马林缓冲液中以进行组织病理学研究[25]。

小鼠血清中总铁含量的分析

The total iron was assessed via microwave plasma-atomic emission spectroscopy of model Agilent 4100, MP-AES (USA). Iron standard stock solutions for the calibration of the apparatus were prepared 在里面 structure of iron inventory options in 0.2% (w/v) nitric acid from the German business enterprise Merck. The mice serum samples were tested for their iron immediately after making ready 1:50 dilution with ultrapure water [25]. Iron was once reported as µg dL‒1.

铁的分析3+ 小鼠血清中的离子含量

血清铁含量3+ ions used to be measured via an Iron Assay kit-Ferene organized via the Iranian organization ZiestChem Diagnostics. The iron connected to transferrin in mice serum samples 在里面 acidic surroundings is generally launched to structure Fe3+ 并转化为铁2+ 通过还原剂。络合物(Ferene‒Fe2+) creates a pink set. The colour depth is relative to the quantity of iron present 在里面 sample which can be estimated at 600 nm. Fe3+ 内容材料曾经被表示为µg/dL.

小鼠血清中肝酶的评估

血清生化分析(AST,ALT和ALP)在BT3000 PLUS型号自动分析仪(意大利罗马的Biotechnica公司)上通过商业比色测定试剂盒(伊朗帕兹阿兹蒙)通过光度法根据国际临床化学联合会进行(IFCC)和实验医学以及德国临床化学学会(DGKC)的标准方法。这些试剂盒的工作基础如下:氨基转移酶AST和ALT通过使用苹果酸苹果酸脱氢酶催化氨基从L-天冬氨酸向2-氧代戊二酸的转换来降低NADH的吸收。 NADH的吸收降低(λ最大= 340 nm)与AST和ALT的氨基转移酶活性增加成正比。对硝基苯基磷酸酯吸光度(λALP的二磷酸化增加了max = 405 nm)。溶液吸收的增加表明ALP活性的增加[26,27]。

小鼠肝脏的组织病理学

组织学检查在“Avicenna”医院(伊朗萨里)。在试验期放弃时,将动物在麻醉下宰杀。立即分离肝脏并用生理盐水洗涤,并立即将部分组织固定在10%福尔马林中。将福尔马林固定的组织植入石蜡块中,并将其一部分切成5毫米的厚度。将石蜡蜡块放在干净的玻璃载玻片表面并将样品固定在载玻片表面后,用普鲁士蓝染色 [28]。通过使用光学显微镜(Lx 400,USA)检查染色的载玻片。

统计分析

使用Prism软件(GraphPad,版本8.0.2(263),美国)来分析从实验中获得的数据。使用普通的单向方差分析,评估显着性,并使用Bartlett进行组间统计比较’的测试。所有记录均以均值表示±标准偏差。表达P<从这项研究获得的所有数据的统计分析中,0.05证实了差异的显着性。

结果与讨论

Changes 在里面 serum total iron content of iron-overloaded mice after exposure to MCAgNPs

The highest iron content measured 在里面 iron-overload group by means of MP-AES was 3745.8 ± 200.2 mg dL‒1, 这是显着的 different (P <0.0001)来自对照组(生理盐水接受组)。在生理盐水组中,铁含量为921± 92.4 mg dL‒1。铁超载小鼠暴露于50 mg和100 mg kg剂量的MC-AgNPs‒1 显着缩小(P <与铁超负荷小鼠组相比,血清铁含量为0.0001)(图。 2A)。显着差异(P <在以50和100 mg / kg剂量暴露于MC-AgNPs的铁超负荷小鼠之间发现0.0001)‒1 而暴露于100 mg kg剂量MCLE的组‒1. Fig. 2 indicates that the diminution of excess iron, more than the plant extract influenced by the nano sized zero valent Ag encapsulated 在里面 extract shell. Furthermore, no difference (P >在仅暴露于MC-AgNPs的组和生理盐水组之间发现0.05)。

Changes 在里面 serum levels of Fe3+ 暴露于MCAgNPs的铁超负荷小鼠体内的离子

最大铁含量(731.0± 44.32 mg dL‒1) was observed 在里面 over-iron group through Fe3+ 通过铁含量测定试剂盒-Ferene测定离子水平,这与生理盐水组明显不同(P <0.0001)相比生理盐水组(213.6)± 29.8 mg dL‒1)(图2B)。铁3+ 与未治疗组相比,用MC-AgNPs治疗的铁过量小鼠中的离子含量显着降低。铁3+ content 在里面 groups received 50 and 100 mg / kg of MC-AgNPs was estimated to be 701.3 ± 60.0 and 635.4 ± 61.8 mg dL‒1,分别(图2B)。再一次,以100 mg / kg的剂量暴露于MC-AgNPs的铁超负荷小鼠‒1 这是显着的 reduced (P < 0.01) in serum Fe3+ 与老鼠相比,铁族过多。同样,发现小鼠体内的纳米颗粒暴露于铁过多并不能还原铁。3+ 与接受生理盐水的组相比。

亚慢性(一个月)毒性研究

In this part, the practical inhibition of the influence of MC-AgNPs on the hepatotoxicity of over-iron deposition in mice has been investigated primarily on the content of liver enzymes. In addition, the protective results of 纳米粒子 在里面 liver of over-iron mice have been reported, as evidenced by a reduction in tissue inflammation and iron deposition in histopathological examination compared to 对照小鼠.

Change 在里面 serum levels of liver-function enzymes after treatment with MC-AgNPs

肝功能酶可以指出肝脏受损,特别是AST,这是小鼠肝脏特有的。 Rezaei及其合作者宣称,血清ALT和AST度与铁中毒直接相关[29]。通过使用这些酶的程度可以评估肝脏特征的变化(图3A)–C),与正常盐水组(AST; P = 0.0184,ALP; P = 0.1308)和ALT相比,铁剂过高的小鼠升高; P = 0.1498)。与未治疗组相比,铁过量小鼠中MC-AgNP处理能够根据剂量减少AST,ALT和ALP的量(P>0.05)。在同一时间,与铁过量的小鼠相比,DFO暴露的小鼠的AST,ALT和ALP程度进一步降低(P>0.05)。总体而言,过度铁小鼠暴露于MC-AgNPs可以从根本上减弱肝功能损害(肝酶的含量)。总之,发现在MCAgNPs治疗组中ALP含量 was lesser than in the DFO-exposed mice and also closer to its control mice content.

普鲁士蓝染色对小鼠肝脏的组织病理学评估

肝脏比器官更容易遭受铁的过度损害。总之,我们利用肝脏组织显示出过度的铁伤害和可能的MC-AgNPs抑制结果。用普鲁士蓝染色的方法用于相关组织的病理调节。在带有铁标的过度铁小鼠中,肝细胞质中的箭头标有蓝色到黑色的铁沉淀物(图4B)。用MC-AgNPs处理后,肝组织中的铁沉积物数量减少了。细胞中多余的铁沉淀有助于产生反应性自由基,这是造成肝损害的重要途径[30]。因为MC-AgNPs已经正确地证明了自由基和铁中和剂的正确作用[13],所以我们认为它们可能还可以作为一种对小鼠带来的铁和肝损害的有前途的疗法。因此,在本研究中,我们调查了 potential MC-AgNPs铁螯合物作为有才华的化合物。结果我们测试了MC-AgNP可能希望限制血清铁度。 MC-AgNPs还成功地降低了肝脏组织中铁的聚集,这主要是减少了组织损伤。纳米粒子已经能够减轻组织炎症。总体而言,MC-AgNP已被确定为一种高质量的材料,可避免或降低动物体内铁含量过低的不安全影响。铁过量的小鼠肝脏中MC-AgNPs的保护结果可能是由于附着在纳米颗粒上的生物分子的抗氧化特性所致[13]。

结论

创新和有前途的混合纳米材料(nAg0 +生物分子)介绍 to reduce excess iron ions in a 地中海贫血 model for the first time. MC-AgNPs 在里面 form of a colloidal solution demonstrates acceptable power for chelating of excess iron and improve pathological changes in iron overload mice, hypothetically providing an alternative creative approach for the treatment of diseases associated with excess iron. According to the results, the decent iron chelating ability of the MC-AgNPs, can be related to both the decent sorption specification of the Ag core as well as the activity of functional groups with negative charge 在里面 biomolecules adhered to the nanoparticle surface. The results suggest a new drug program from MC-AgNP, which requires further investigation.

致谢

在此,所有作者对Mazandaran医科大学研究与技术副校长(伊朗萨里)表示感谢和感谢,感谢他们协助撰写了该论文(第1250号)。通过这种方式,作者感谢医学院(伊朗萨里)细胞分子研究中心的同事,“Avicenna”医院(伊朗萨里)和本研究的所有成员。

利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

 

 
24.滕B,张T,龚Y,陈W.马占相思树皮中单宁含量的分子量和鞣制特性。非洲农业研究杂志, 2013; 8(47):5996-6001。
29. Rezaei H. tiv仁水醇提取物对实验性铁超载大鼠的保护作用。 Jundishapur天然药物产品杂志, 2018;13 (2).